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    毛木耳多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶A活性的影响


    【发布日期】:2004-09-29  【来源】:
    【核心提示】:毛木耳多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶A活性的影响王道福邵林萍鞠保文丁望(89医院潍坊261000)毛木耳多糖(Au

    毛木耳多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶A活性的影响

    王道福 邵林萍 鞠保文 丁望

    (89医院 潍坊261000)

    毛木耳多糖(Auricularia polytrica Sacc polysac caride,APSP)系从担子菌纲银耳科毛木耳(Auricularia polytrica Sacc)子实体中提取,具药食两用价值,有滋补强壮、扶正固本之功效。现代药理学研究证明,毛木耳多糖具有免疫增强和抗肿瘤作用,但其作用机制尚未明确。为进一步探讨毛木耳多糖的作用机理,本文采用PLC法,测定毛木耳多糖均一体组分APSP-A对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)PKA活性的影响。

    1 材料和方法

    1.1 药品和试剂毛木耳多糖(APSP-A):按文献方法提取〔1〕,化学性质属酸性杂多糖,由甘露糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖及少量糠醛酸组成,4种单糖的分子比为320∶10∶018∶005,分子量12万,实验时以EPES缓冲液配成所需浓度,滤膜过滤,消毒,4℃保存。RPMI-1640培养基:Gibco生命技术公司产品。胎牛血清(FCS):杭州四季青生物工程公司。EPES缓冲液(p 72~74)、Sucrose、DTT、Leupetin、histone(Ⅲ-s)、PMSF、ATP、ADP、AMP、cAMP均为Sigma产品。甲醇、PiCA,皆为国产色谱纯。

    1.2 动物:昆明种纯系小鼠,♀♂不限,7~8周龄,体重232~255g,由昌潍医学院实验动物中心提供。

    1.3 巨噬细胞的培养:按文献方法〔2〕无菌取小鼠腹腔MΦ,经苔盼蓝染色细胞活率90%以上,调整细胞浓度为108~109/L,接种于多孔培养板中,置含5%CO2,95%空气孵箱中,37℃孵育24。对照组皆以RPMI-1640完全培养基替代,实验组中加测试药物等处理因素皆以RPMI-1640完全培养基溶解和稀释。

    1.4 PKA活性测定

    1.4.1 PKA的制备:按文献方法[3]操作。

    1.4.2 PKA活性测定:参考文献[4]以反相离子对高效液相色谱法测定〔4〕。色谱条件:C18柱、流动相:甲醇:磷酸盐缓冲液(21∶79V/V,p69,内含6mmol/L PiCA)、流速1ml/min、检测波长259nm、柱温为室温、0.01AUFS、进样量10~20μl。

    1.4.3 蛋白含量测定:按Lowry法测定。

    1.4.4 PKA活力定义:一个酶活力单位相当于每分钟使组蛋白istone(Ⅲ-s)磷酸化而消耗1nmol ATP所需的酶量。

    1.5 统计学处理结果以?x±s表示,所有结果显著性差异皆以配对资料t检验处理。

    2结果

    毛木耳多糖对小鼠MΦ中PKA活性的影响:以80mg/L APSP-A与MΦ一起孵育不同时间后,测定PKA总活力。结果显示:APSP-A可明显增强小鼠腹腔MΦ中PKA总活力,8min时达到峰值,至20min恢复到基础水平(图1)。在8min时APSP-A与PKA的量效关系具有一定浓度依赖性(r=08958,表1),实验测得PKA的基础总活力为(9686±688)nmol?min-1?mg-1(n=3,x±s)。

    3讨论

    蛋白激酶是催化体内蛋白磷酸化的酶类,而蛋白磷酸化则是体内各种生物反应最终起作用的通路。PKA是一类cAMP依赖性蛋白激酶,是整个cAMP作用的分子基础,在真核细胞内几乎所有cAMP的作用都是通过活化PKA,从而使底物蛋白发生磷酸化而实现。本实验证明毛木耳多糖可引起小鼠腹腔巨噬细胞PKA活性明显升高并具有一定浓度剂量依赖性,提示其免疫增强作用可能与活化PKA有关。

    参 考 文 献

    1 吴春敏,等毛木耳多糖的分离、分析及免疫药理活性的研究中国药科大学学报1991;22(2):97

    2 鄂征主编组织培养技术北京:人民卫生出版社,1993:185

    3 李明春,等灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶A活性的影响中草药2000;31(5):353

    4 李明春,等反相离子对PLC法测定细胞中蛋白激酶活性中国生化药物杂志1999;20(5):233

     
     
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