双孢蘑菇菌种选育的主要方法有两种。第一，通过比较筛选来获得具有优良性状的菌株；第二，在菌株间进行杂交来产生并利用新的变异。育种者的目标是要把控制重要商品性状的基因组合在一起，以获得既高产、优质又抗病的商品菌株。
一、双孢蘑菇菌种选育进展
自有人工栽培双孢蘑菇以来，菌株选育的方法得到不断的发展。大约在1700年以前， 人们就已经在户外， 比如马厩或牛马车经过的路旁采集蘑菇菌种。Abetcrombic(1779)报道说：马粪菌种可以根据其具有强烈蘑菇气味的特性来识别。用这种方法获得的菌种，可靠性差。十八世纪九十年代法国人使用试验室萌发的蘑菇孢子制种取代了从自然引种，这方法传进了美国，Lambert于1929 年提出子实体能从单孢子萌发的菌丝体产生，并公开了用蘑菇孢子和组织培养物制种的秘密，促进了选种工作的开展。早期的选种方法基本采用多孢分离，但改良菌株的进程缓慢，Sinden(1981)叙述了他采用多孢筛选法获得A6菌株的经过，他前后经过近三十年的努力，但A6也不是十分理想的菌株。我国过去采用多孢筛选法前后约有三十年，但始终没有留下明显进步的菌株，这和我国把选种作为制种的一个程序，年年选，年年弃，没有把良种留下有关。然而多孢筛选法，在遗传上均一性大于变异性，理论上难于获得具有明显性状的变异株。要有效地选育新菌株，得寻找别的方法。
单孢分离筛选比多孢筛选具有更大的机率获得明显性状的新菌株。尽管单孢分离是一种费时的工作，但采用此法，确能获得比较好的菌株 ( Fritsche ， 1972;Kneebone et al，1976)。福建省轻工业研究所于1983 年后从一些菌株中分离了近千个单孢培养物，获得了10株具有较好种性的新菌株，其中"闽一号"菌株曾在省内外广泛使用。
虽然多孢分离和单孢分离选种曾经为双孢蘑菇商业性栽培提供了许多重要的菌株，但是这些菌株仍然存在难以克服的缺点，就是高产的菌株常常不优质，而优质的菌株常常不高产，单产甚至只达高产菌株的一半。为了选育兼具高产与优质特性的菌株，育种家很自然地着眼于杂交方法的研究。杂交在动植物育种中的应用已有长久的历史而且取得巨大的成就，为什么在双孢蘑菇育种中迟迟没有实现呢？在技术上有两个障碍，一是双孢蘑菇遗传特性特殊， 大多数孢子是自身可育的。 时至1980年，Sinden在第二次北美蘑菇会议上还说“杂交既无可能，又很困难……”并认为“自从Lambert博士指出蘑菇完全可以用单孢子培养进行自体繁殖以来， 关于杂交的种种希望已经变得暗淡起来”。第二个障碍是如何鉴别杂种。对蘑菇遗传系统的深入研究，指导着蘑菇选育种工作的进展。1980 年荷兰 Horst 蘑菇试验站的Fritsche利用蘑菇不育单孢子培养物配对，以恢复可育性为标记选育杂交菌株，使杂交技术切实可行，于1981年首先育成纯白色蘑菇品系和米色蘑菇品系间杂交的品种U1和U3，并在欧洲广泛使用。随后，各国蘑菇育种者也相继推出杂交菌株( 王贤樵，1990;王泽生等，1991)。目前生产用种几乎已全被杂交菌株取代。
至于如何鉴别杂种呢？总的说是要使用于杂交的亲本具有某种遗传标记。1972年Raper等提出利用营养缺陷型标记，1978年 Elliott 利用菌株的抗药性为标记，1982年Royse和May提出应用同工酶作为杂交标记。1988年Castle等利用DNA的RFLPs多态性为标记。1992年，Khush等，1994年， 福建省轻工业研究所与厦门大学合作研究利用DNA的RAPD多态性为标记。其中，同工酶标记和RAPD标记被广泛采用。
最近几年利用生物原生质体融合再生育成杂种的技术在双孢蘑菇育种工作中的应用研究也有了开端，这给种间杂交带来可能性。我国许多单位也在研究种间杂交的技术。原生质体技术还被应用于获得同核体(Castle，1988;Wang，1990)。 分子生物学的进步在育种上发展了基因工程，把人们需要的一个或几个基因片段从一个细胞分离提取出来，转移至另一个细胞中去，使外来的基因整合到受体细胞DNA上，改变了受体细胞的遗传信息，无疑，这将给育种家开辟出广阔的前景，育成双孢蘑菇理想的菌株，为时将不会太远。
目前，同核不育单孢配对杂交仍然是双孢蘑菇育种的有效方法，但产生的杂种子代并不都具备亲本的优良性状。为此，育种者不但要求能鉴定杂交，更希望能迅速有效地育成优良的杂交菌株，这就需要寻找与种性相关的标记并探索杂交菌株的遗传规律，。1987年，王贤樵和王泽生提出应用同工酶电泳法预测双孢蘑菇菌株的特性。1990年，王泽生等提出双孢蘑菇杂种子一代与子二代遗传变异的酯酶同工酶模式。指导育成的杂交菌株AS2796系列已在全国推广使用。
二、双孢蘑菇育种的目标
从三百年来双孢蘑菇选育种技术的演变，看到了育种家辛勤的劳动，那么育种家追求的目标是什么呢？Fritsche(1981)说：“过去，首要的是提高单产，而现在先决的是提高质量，这在将来仍然如此，因为竞争更加激烈。”
1981年May提出：“在植物育种方面作任何尝试之前， 育种家要在头脑里牢固地建立所需菌株的模式。”一种理想模式菌株的指标：子实体应是白色的、光滑的、对称的、成比例的、结实的。菌盖直径在3.0-5.0cm之间，大小均匀， 菌株高产稳产，对大多数病虫害具有高水平的抵抗能力并且有较长的货架寿命。
１、白色：随着鲜菇市场的发展，蘑菇栽培者将随消费者的喜爱而栽培白色的品种。
２、菌盖光滑：对消费者说，虽然稍有鳞片的品种是可以接受的，但大多数消费者似乎更喜欢表面光滑的品种。
３、菌盖对称：从上面看时，菌盖应呈匀称圆形，从侧面看时，菌盖应呈微凸形的冠状。
４、菇形成比例：菌盖和菌柄的比例必须符合审美观的要求，一个好看的蘑菇应具有不会太细、太长，也不会太短太粗的菌柄。
５、菇体结实：结实说明菇体密度大，菌盖和菌柄应是紧密的而不是海绵状的或空心的。
６、大小适中：菌盖均匀，直径在3.0-5.0cm之间的蘑菇采收快， 处理方便，受消费者欢迎。然而，某些市场喜欢更大或更小的蘑菇。
７、对病虫害的抵抗力：选育对病虫害有抗性的品种几乎是所有植物育种者的一项主要工作，需要把抗病害，特别是抗轮枝霉病的抗性结合在理想品系中。
８、更高产稳产：选育一株对环境适应性更广，生物效率更高的栽培种是必要的。这个目标包括需要更好地了解限制产量这个因素的遗传机制。
９、具有较长的货架寿命：选择具有较长货架寿命的蘑菇品系可能是增加经济效益有效的方法，一些因素如氧化速率、颜色变化速率、重量减轻速率等均影响蘑菇的货架寿命。
在我国，大部分蘑菇是用于罐藏加工，理想的菌株除了基本符合以上提出的指标之外，尚要重视菌褶大小和颜色。菌褶颜色太深，在罐藏加工之后，特别是制成片菇或碎菇，菌褶发黑，菌盖切面灰暗，是感观评定的大忌，此外，菇体是否结实也反映到加工原料吨耗的高低，也将直接影响加工的原料成本。
三、双孢蘑菇同核不育单孢配对杂交定向育种
双孢蘑菇选育种技术与方法经历了自然采种、纯种培养、组织分离保种到多孢子分离和单孢子分离选种，曾经为双孢蘑菇商业性栽培提供了许多重要菌株。随着对双孢蘑菇遗传规律的深入了解和生物技术的不断进步，杂交成为全世界当前改良蘑菇品种的重要手段。不同类型商业菌株混合培养的方法，难以产生、发现杂交种。同核不育单孢配对杂交是当前使用最广泛的方法。原生质体融合作为蘑菇种内育种手段，主要是强制配对培养不亲和组合发生杂交，作为种间杂交育种（比如双孢蘑菇与大肥菇杂交）仍处于研究阶段。DNA 水平的目的基因转化育种目前还处于基础理论研究与实验技术建立的时期，离应用尚有一段时间。下面主要介绍同核不育单孢配对杂交技术。双孢蘑菇同核不育单孢配对杂交的程序可由下图表示。
双孢蘑菇种质的收集
↓
种质的亲缘关系与农学性状分析、鉴定
↓
选出具最小遗传相似值又各具相对优良性状的组合
↓ ↓
亲株１←─遗传标记─→亲株２
↓ ↓
同核不育单孢1 同核不育单孢2
↓ ↓
在平皿培养基上配对培养
↓
从菌落接触区域分离菌丝体
↓
菌丝尖端分离、培养
↓
遗传标记鉴定杂种F1，预测菌株特性
↓
栽培试验，选优
↓
进行F2单孢分离，预测菌株特性
↓
栽培试验，选优
图5-6 双孢蘑菇同核不育单孢配对杂交育种程序
福建省轻工业研究所从1983年以来以酯酶同工酶电泳多态性为遗传标记，建立了鉴定菌株的基因型、分析菌株间的亲缘关系、推定同核体不育株、鉴定杂交、预测新菌株特性、分析杂交菌株子代遗传变异规律的一整套技术。结果表明酯酶同工酶分析是一种快速、有效且成本低廉的遗传标记技术，一般大专院校与科研院所均能开展。
（一）种质收集、鉴定与亲缘关系分析
充分地收集双孢蘑菇的种质，包括栽培菌株和野生菌株，建立种质库乃至构建基因文库对于蘑菇选育种是至关重要的。
通常都认为蘑菇栽培起源于法国，传到北美，然后扩散到世界各地。仅有欧洲（法国等）和北美（美国加州）有报导发现并利用了双孢蘑菇野生种质。据说在我国新疆、山西、安徽的野地里也发现过双孢蘑菇，但是到目前为止仍未真正获得野生种质(王泽生，1993)。为了充分收集、利用极其有限的蘑菇种质，Kerrigan博士于1988年发起了全球性收集鉴定蘑菇种质的计划(ARP)，获得了各地的响应。
收集来的蘑菇种质材料可以是孢子或子实体组织分离培养物，它们可以用多种方法予以保藏（将在第四章阐述）。蘑菇种质类型的叫法多样，有分为栽培菌株与野生菌株的，有分为双孢菌株和四孢变种的，有分为棕色菌株、浅棕色菌株、奶油色菌株、米色菌株和白色菌株的，也有分为匍匐型菌株、气生型菌株和中间型菌株。蘑菇种质的鉴定可以用同工酶电泳(Royse等，1982; 王泽生等， 1989) 、 DNA 的RFLPs(Castle，1988)和RAPD(曾伟等，1997)方法进行， 用聚类统计方法分析菌株间的遗传相似性及种群间存在的遗传差异性(图3-7)。 一些生物统计软件上也配备有聚类分析程序。
图3-7 ３９个双孢蘑菇白色菌株的遗传相似程度系统树
以同工酶电泳区带的迁移率(Rm)为依据比较分析同工酶类型差异、推定基因型变异。把表型完全一致的菌株归于同一基因类群。二基因类群间的遗传相似程度值S=NS/NS+ND。NS代表Rm值相同的酶区带数，ND代表Rm值不同的酶区带数。当比较的酶多于一种时，取各遗传相似值的平均数作二基因类群间的总遗传相似值。基因类群间的遗传相似程度系统树的计算与绘制用类平均聚类法，把遗传相似值最相近的基因类群组合成新类群，再计算该类群与其他类群间新的遗传相似值，进一步把最相似的类群组合在一起，直到所有类群配成一个家系为止。以系统树反映菌株间的种内亲缘关系。
从世界各地收集、鉴定、保藏蘑菇菌株所发表的资料来看，双孢蘑菇的种质资源十分有限，种质库里现存的遗传差异性也较小。
（二）菌株特性预测
经过长期的人工栽培，人们对双孢蘑菇的种性有了较多的了解。福建省轻工业研究所根据栽培特性、鲜菇质量和罐藏加工表现差异，把双孢蘑菇菌株大致分为高产类型、易褐变类型、中产类型、优质类型和不育类型（表3-1）。但是， 一个新引进、新分离或新杂交培育的菌株，播种后能否结菇？质量怎样？是否高产？以前，只能靠多次、大量的栽培观察，对比筛选来直观评定，假如能从分子水平找到某种可以用于实验室早期预测新菌株的栽培特性与产、质量性状的指标，将大大减轻筛选压力，提高选育种的效率。
表3-1 双孢蘑菇不同类型菌株的特性
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高产类型： 单产与菇潮 结菇早，一、二潮菇集中、高产
菌盖与菌柄 盖扁平，有时凹顶，有鳞片，柄髓部松软，
菌环明显
菌褶与颜色 菌褶大，菌褶和周围组织褐色或红褐色。
罐藏质量 组织松软，菌褶和周围组织色灰暗，菌盖
和菌柄空心，高收缩率。
优质类型： 单产与菇潮 结菇较迟，菇潮均匀，较低产。
菌盖与菌柄 盖圆整，柄粗短，光滑无鳞片，组织致密。
菌褶与颜色 菌褶小，肉色或淡粉红色。
罐藏质量 组织致密，色淡黄，风味好，低收缩率。
中间类型： 单产与菇潮 结菇早，菇潮明显，产量中等。
菌盖与菌柄 盖圆整，光滑，时有菌环，组织密度中等，
柄中等粗，常有小菇、薄菇。
菌褶与颜色 菌褶大小中等，颜色旦粉红或浅褐色
罐藏质量 组织密度中等，色淡黄或偏土黄，收缩率
高或中等
易褐变类型： 单产与菇潮 结菇早、菇潮明显，非常高产。
菌盖与菌柄 盖厚，较圆整，有菌环，柄直细，组织密度中等。
菌褶与颜色 菌褶较大，呈褐色或褐红色并蔓延至周围组织。
罐藏质量 菌褶与菌盖组织深灰色，收缩率高或中等，
罐藏质量差。
不育类型： 菌丝生长缓慢，细弱，不结菇。
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众所周知，酶是基因的直接产物，又是性状表现的调控者。因此，可以设想菌株特性明显不同的双孢蘑菇菌株之间在某些同工酶遗传基础上存在差异。福建省轻工业研究所对150 个从国内外收集的各类型菌株作了酯酶等同工酶电泳检测分析，把特定区带定为标记区带，把具相同标记区带的同工酶类型归于同一大类型，再和菌株栽培表现类型相比较，发现同工酶电泳表型与菌株特性表型存在着相关性（表3-2）。荷兰的Neut(1991) 也把酯酶同工酶电泳表型多态性用作为菌株特性鉴定和育种检验的指标。
表3-2 双孢蘑菇菌株特性和酯酶同工酶电泳表型
* 可划归为H大类型
（三）同核不育单孢菌株的分离、鉴定
同核不育单孢分离鉴定的方法有多种。第一，可以用显微操作器直接从双孢蘑菇稀有的３孢或４孢担子上直接分离单核孢子，这种方法操作难度大且费时。第二，随机分离单孢培养物，挑选生长弱慢的培养物作遗传标记鉴定。第三，在异核亲本原生质体再生单株培养物中挑选生长弱、慢的培养物作遗传标记鉴定。第四，使用四孢变种的单孢培养物。
王泽生等(1990)用第二种方法，从14个异核亲本中共分离出2578个单孢培养物，其中生长弱慢的有374株，占14.5%，经同工酶电泳鉴定为S型的共158株，推定为同核不育培养物的约占单孢分离物的6.1%。栽培中S 型培养物大多数在堆料中定植很慢，生长弱，或基本不生长，即使生长了也基本未见结菇。同核不育菌株的同工酶表型均表现为一些电泳区带缺失，这与用DNA的RFLP及RAPD 分析鉴定同核不育菌株的研究结果一致。
（四）配对杂交技术与杂交种的鉴定
配对杂交要选择遗传相似值小，且具有相对优良性状和不同遗传标记的组合。一旦异核亲本选定，即可分离同核不育菌株。通常认为用原生质体再生法获得的同核不育株是无性繁殖的产物，不发生变异，可直接用于配对杂交。但用单孢子分离法获得的同核不育株一定要进行遗传鉴定，因为单孢子是有性生殖的子代，可能发生变异。应该选择保持异核亲本遗传标记的同核不育株用于杂交。
配对杂交结果还受到培养基的影响。有报导(王泽生等，1990)同一配对组合在不同的培养基上配对培养可表现为亲和或不亲和（表3-3）。 配对组合的亲和性不但受性因子控制也受培养基成份的影响。麸皮培养基或蘑菇堆肥培养基适用于配对杂交。但仍有一些配对组合在常规培养基上不易发生杂交，此类组合可以用原生质体融合法强制杂交(王泽生等，1991)。
表3-3 不同培养基对同核体配对杂交亲和性的影响
a.培养基Ⅰ-Ⅳ分别为麸皮培养基,PDA,PDA+10%啤酒,PDA+0.1%烟酸;
b.1-5分别代表互相作用区域菌丝生长速率由小到大,"0"代表形成拮抗线;
c."+"代表同工酶鉴定菌丝杂交,"-"代表不亲和。
图3-8 双孢蘑菇同核不育单孢配对杂交(左边示亲和杂交,右边示不亲和,不能杂交)
通常把配对组合的培养物成对地接种在培养基上（图3-8）。 凡二培养物间不形成拮抗线，并产生互相作用的组合记着可能亲和。从每个互相作用区域均分离３个菌丝块，转移到新鲜培养基上培养10天左右，在无菌室中用显微操作器镜检并用微型打孔器分离数个菌丝尖端培养，只有生长快且有力的分离物供同工酶电泳分析和制种。凡是同工酶电泳出现杂合酶谱的组合均定为真正亲和并把其菌丝尖端分离物鉴定为杂种F1，投入栽培检验可育性。
图3-9 双孢蘑菇杂交菌株及其同核与异核亲本的酯酶同工酶PAGE电泳图谱
杂交种的同工酶电泳表型基本上表达了双亲的标记区带（图3-9）。 作者在杂交中观察到有250个配对组合发生了可能亲和的现象，从互相作用区域分离出750个菌丝块，经菌丝尖端分离，同工酶鉴定有175 个组合真正亲和产生了具有杂合酶谱的异核体杂种F1。投入栽培后，有84个组合产生的杂种F1恢复了结菇能力，对这种F1菌株还可进行单孢分离以获得重组体。
（五）杂交菌株的使用、变异、复壮与改良
Fritsche的贡献
Gerda Fritsche 1992年出生于德国，1957年在汉堡Max Planck 植物育种研究所开始从事蘑菇的研究。1971年来到荷兰Horst蘑菇试验站，1991年退休， 从事蘑菇选育种工作三十四年。Fritche 最大的贡献是利用双孢蘑菇不育孢子培养物配对杂交以恢复可育性为标记选育杂种，使杂交技术切实可行，于1981年首先育成了U1和U3，使双孢蘑菇育种技术发生了一个飞跃。在她退休时，荷兰Horst 蘑菇试验站筹办了一次国际蘑菇科学会议并将会议上发表的论文编辑成论文集《蘑菇的遗传与育种》("Genetics And Breeding Of Agaricus")出版， 展示了现代双孢蘑菇育种技术的进展。国际蘑菇科学会议尊崇她为该会终生会员。
U1在生产上的使用
1981年Horst试验站要把U1和U3推向市场，和Darlington 菌种公司联合进行了谨慎的栽培试验，起初U3表现比U1高产，后来菇农掌握了更不易栽培的U1的栽培技术，很多菇场转而栽培质量更好的U1。Darmycel菌种公司得到允许使用U1，每6 个月由Horst试验站向Darmycel提供一批新的母种。菌丝体取自堆肥培养物， 另外还保藏在小麦琼脂斜面上和液氮低温罐中。
U1的复壮与改良及其存在的问题
1987年发现U1菌株发生变态，如菌盖趋于扁平，柄和盖的连接处产生空心使菇盖易于脱落，单产明显下降等。 为了使 U1 复壮， Horst 试验站作了很多努力。Fritsche从那时起到退休止，几乎都为了这问题而工作，曾经采取以下措施:
(1)使用原始两个同核体配对，拟用重建的、表现好的新异核体制作生产用种，沿用"U1"菌号投放市场，但未获得理想的重建异核体。
(2)使用原生质体克隆再生培养物，仍表现硬开伞、低产。
(3)使用U1子二代的多孢培养物，表现不一，有时单产明显下降， 有时转管后产量下降。
(4)使用子二代的单孢培养物，发现巨大的变异性。
以上这几种尝试，只有第４个措施，筛选子二代的单孢培养物，表现出有希望获得可取代U1的新菌株。虽然子二代的培养物间存在着巨大的变异性，筛选工作量是庞大的。
为了获得更好的菌株，Fritsche还尝试要结合U1和白色菌株Le Lion B92 的优点而进行了U1的改良工作。她把U1子代的不育株和Le Lion B92 子代的不育株进行配对杂交，在161个组合的子代中筛选，发现无一可取，再从17个杂交产物(子一代)收集孢子。每个样品大约分离40个单孢培养物(子二代)，有633 个单孢培养物参加了筛选，也没有获得理想的菌株， 而分离自另一孢子样品的单孢培养物， 具有与U1相似的子实体质量，并具更光滑的盖，然而它们的产量低，为获得高产株，从这个孢子样品继续分离单孢子培养物，初步的出菇试验结果还是令人鼓舞。
存在问题的剖析
综上所述，U1的育成、保种、复壮和改良可发现存在以下几个问题：
(1)育种的进程单纯依靠机率，以出菇对比为筛选的唯一手段。
(2)为了达到"复壮"的目的，进行了各种尝试，在摸索中进行，作了许多虚工。
(3)U1的育成是米色与白色两个同核体配对杂交而得的子一代(F1) 所含的两个核来自父本和母本，但未曾经过核配，这或将影响U1的稳定性。
(4)使用原始两个同核体配对，重建的新异核体表现多样，不能视为U1的复壮，也不应该沿用U1菌号。
剖析U1菌株育成的方法、保种中的变异和为了复壮与改良所采取的措施，可以发现除了以恢复培养物的可育性为杂交标记之外，没有涉及杂交菌株的遗传规律的探索，以致在育种中仅以子代菌株的表型为取舍的唯一依据，以出菇对比为唯一的筛选手段。在菌株发生变异之后采取的复壮与改良的措施也缺少理论的指引，只能在摸索中进行多种尝试，而作了许多虚工。
（六）杂交子代的遗传变异
1983年以来福建省蘑菇菌种研究推广站建立起同工酶电泳法分析双孢蘑菇菌株间的亲缘关系、预测蘑菇菌株的特性、同工酶电泳推定同核体、同工酶鉴定杂交，构建了杂交子一代与子二代遗传变异的酯酶同工酶(EST)模式。 在双孢蘑菇杂交育种工作中起了导向的作用。1987年在西德召开的国际蘑菇科学会议上首先展示了双孢蘑菇不同类型菌株的五种同工酶的垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)表型和U1及U3等菌株的酯酶同工酶的 PAGE 表型。 1990 年又在 Micologia Neotropical Aplicada 等专业刊物上发表了“双孢蘑菇杂交育种技术研究”“双孢蘑菇杂交菌株的同工酶表型和菌株特性”等篇论文，引起国际同行的重视。图3-10与图3-11表示双孢蘑菇传统菌株及其杂种子一代与子二代遗传变异的酯酶同工酶(EST) 模式和双孢蘑菇杂交育种程序。
图3-10 双孢蘑菇传统菌株及其杂种子一代(F1)与子二代(F2)遗传变异的酯酶同工酶(EST)模式。虚线表示出现该变异的机率很小或尚未发现。 单实线表示能够较经常出现该遗传或变异。双实线交叉指向表示能够通过配对杂交获得所指类型。
从世界各地搜集各类菌株
↓
应用同工酶电泳法分析菌株间的亲缘关系
↓
选出具有最小遗传相似值，又各具相对优良性状的组合
↓ ↓
H型菌株 G型或HG1-2型菌株
↓ ↓
Hs型不育单孢株 同工酶检验 Gs型或HGs型不育单孢株
↓ ↓
在平皿培养基上配对培养
↓
从亲本菌落接触区域分离菌丝体
↓
尖端菌丝分离、培养
↓
同工酶鉴定HGx型杂种F1
↓
出菇试验
↓
收孢进行F2单孢分离，同工酶电泳预测种性
↓
出菇试验
图3-11 酯酶同工酶标记指导双孢蘑菇同核不育株杂交育种程序
研究表明H型(米色，高产)同核不育株(HS)与G型(白色，优质)同核不育株(GS)配对杂交，可以获得G1-5，HG1-2，HG4-5等类型子一代，其中只有HG4和HG5呈典型杂合态。U1即属于HG4型。从HG4和HG5 的单孢子二代中几乎能分离出所有传统菌株类型(H，HG，G)与多种重组类型(HG6-HG17)、同核不育型(HS，HGS，GS) 和杂合类型(HG4，HG5)。子一代的HG4型和HG5型以及子二代的HG4型和HG5型杂交菌株均可表现出父本和母本的一些性状，是目前筛选较有希望的类型。
几年来,以高产优质深受菇农欢迎并得外销部门和罐头厂认可的杂交新菌株"闽4号"(As2796)(图3-12)就是从HG4型杂交子二代中选育出来的。 该菌株在福建省栽培面积占90%以上，在全国已累计推广2亿多平方米，产菇近200万吨,成为全世界推广栽培最广泛的杂交菌株之一(王泽生等,1995)。其育成程序如图3-13所示。
图3-12 双孢蘑菇杂交新菌株As2796(中)及其亲本菌株02(左),8213(右)
图3-13 杂交新菌株闽4号(As2796)育成程序
（七）蘑菇育种新技术与种质利用
高产、优质、抗病的双孢蘑菇新菌株的育成依赖于育种技术的不断进步和种质资源的充分利用。
1.同工酶电泳技术
所谓同工酶是指能催化相同生化反应，而结构及理化性质不同的酶分子形式。1959年Market用电泳分离法首次发现了动物的乳酸脱氢酶具有多种分子形式，并将其称为"isoenzyme"或"isozyme"，即同工酶。至今已发现了数百种具不同分子形式的同工酶。
检测同工酶的技术， 最广泛采用的是凝胶电泳法， 有聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)系统，琼脂糖凝胶电泳(AGE)系统和淀粉凝胶电泳系统等等。电泳方式有卧式平板、垂直柱状和垂直平板等等。按电泳性质又有不连续系统、SDS系统、 等电聚焦系统等。电泳是利用同工酶具有不同的分子结构、氨基酸序列或组成有差异而引起酶分子带电，分子形状、大小等差异，使同工酶在同一电泳系统中具有不同的电荷或不同的电荷数。又经过凝胶分子筛的过滤（不连续系统还有浓缩效应），从而分离成迁移率(Rm值)不同的区带，经过组织化学染色等，显示出酶谱。酶谱可制成干片归档，亦可拍照保存。酶谱的定性分析可通过Rm值测量比较进行，利用薄层色谱扫描仪，比如CS-930双波长薄层扫描仪等，能对酶谱进行定性和定量的自动分析处理。
因为同工酶是基因的直接产物，主要是由不同等位基因或不同基因位点编码的，同工酶的电泳表型是基因型的反映。因此，它不仅是生理生化的指标，而且是可靠的遗传标记。可以成功地区分种一级分类单位，也可鉴定未知真菌。以双孢蘑菇为材料研究或应用过的同工酶类有数十种，其中应用最广泛的有酯酶(EST)， 乙醇脱氢酶(ADH)，多酚氧化酶(PO)，过氧化物酶(POD)，肽酶(PEP)等。
同工酶技术包括3个方面，即样品提取，凝胶电泳和染色观察。
1.1 样品提取
供试菌株接种于PDA培养基斜面上，22-25℃培养15-20 天取出用接种刀刮下菌丝按1:3:0.5的比例混合菌丝(g)，0.1M磷酸缓冲液(ml)和石英砂(g)， 置冰浴中研磨成匀浆，4000-10000转/分离心20分钟，取上清液，按5:1:1的比例混合上清液，40%蔗糖，和0.01%溴酚蓝溶液，作为电泳样品置冰箱备用。子实体取制罐用鲜菇的盖、褶或柄组织5或10g冰浴研磨成匀浆，以下同菌丝制作。
1.2 电泳:这里主要介绍常用的聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳(PAGE)。PAGE 的最大优点在于可以通过选择单体浓度或单体与交联剂的比例，而得到不同孔径的凝胶，以适合于分离不同分子量、不同结构的酶蛋白。应用中多采用不连续电泳，即通过浓缩胶的浓缩效应和分离胶的筛分效应，将同工酶分成一条一条的狭窄的区带。分辩率比琼脂糖凝胶、淀粉凝胶高。
1.2.1 分离胶制备:备好洗涤干净的垂直板状电泳槽，装好胶模，然后制备分离胶。用pH8.9Tris-HCl缓冲液加上Acr-Bis液，TEMED，蒸馏水混匀，再加10%过硫酸铵，迅速摇匀，灌胶，并用蒸馏水封住胶面，静置聚合。待聚合完全后，倾出胶体上端的水层，用细滤纸条吸干胶层上的残余水迹。分离胶的浓度以9%为宜。
1.2.2 浓缩胶制备:用pH6.7 Tris-HCl缓冲液加上Acr-Bis液，TEMED，蒸馏水， 再加10%过硫酸铵(或4%核黄素)即摇匀，灌胶于已聚合好的分离胶上，插入样品模卡，静置聚合(加4%核黄素要有光照聚合)。
1.2.3 装槽点样:拆去样品模卡，装槽，注入电泳缓冲液(pH8.3Tris-甘氨酸)， 每个样品孔点样75ul。
1.2.4 电泳:电泳槽置于3℃下120V电泳20分钟后稳压4小时左右， 在溴酚蓝指示带离底部1厘米时停止电泳。
1.3 染色与观察
拆下电泳板块，用蒸馏水边淋洗边转移板状凝胶于染色盘中，倾去蒸馏水，加染色液染色。不同的同工酶的染色配方不同，有的对温度、光照等因素还有特别要求，可查阅有关文献。现把常用的几种同工酶染色方法列于表3-4。
表3-4 双孢蘑菇部分同工酶和水溶性蛋白染色液成份
2.原生质体融合技术
在双孢蘑菇杂交育种中引入原生质体技术有三方面的好处。第一，通过原生质体再生法，可以较快速地获得同核菌株用于杂交。这种菌株是无性操作的产物，在遗传上比有性生殖产生的同核菌株更接近于亲本。第二，细胞壁不亲和的配对杂交组合或亲缘关系相近的蘑菇种间，比如双孢蘑菇与大肥菇，可以通过去壁产生原生质体，再融合而实现杂交。第三，原生质体还可以作为外源基因转化的受体。下面介绍双孢蘑菇原生质体制备、再生与融合的实验原理、材料与方法、试验结果与存在问题。
2.1 原生质体制备
把双孢蘑菇的菌丝体、子实体组织或孢子置于适合的溶壁酶液中，在适宜的温度、pH条件下，经一定时间的酶解，降解掉细胞壁后即可游离出由细胞膜包围的球状体，即原生质体。失去细胞壁保护的原生质体对渗透压敏感，低渗下易破裂。因此，原生质体形成率受制备材料的类型与生理状态、溶壁酶类型与浓度、溶壁酶液的稳渗剂类型与浓度及酶解的温度、pH与时间等因素的影响。选择适宜的条件是制备大量的、高活力易再生的原生质体的关键。
以菌丝体为材料制备双孢蘑菇原生质体包括：菌丝培养、原生质体制备、分离、纯化与镜检几个步骤。首先，把双孢蘑菇菌丝块接种于装有液体完全培养基的三角瓶中，在24℃下静置培养5-10天，把菌丝体取出沥干，并用0.6MKCl溶液冲洗2遍，用滤纸吸干。按0.5G鲜重菌丝加1ml溶壁酶的比例混合，在24℃下溶解2-6小时，定时取样镜检，并用血球计数板计算原生质体形成率。当形成率达107个/ml左右时进行提纯。原生质体悬液经G2或G3漏斗过滤，或300目左右的尼龙网过滤， 也可用无菌脱脂棉或玻璃棉丝过滤。滤液经1500rpm离心10分钟，弃上清液， 沉淀下来的原生质体用等量稳渗液稀释，可重复离心一次，即得原生质体精制悬液。原生质体的去壁情况可以加入萤光增白剂等予以检验(壁成分可染上)，也可以用低渗处理检验原生质体的破裂情况来初步判定去壁效果。原生质体活力检验可以加0.1%中性红染色，染上者为失活。
有关研究探讨了菌龄、溶壁酶、稳渗剂和酶解条件对原生质体形成的影响。
①菌丝菌龄 使用不同菌龄的菌丝制备原生质体的结果差异很大。菌龄太小，生成的菌丝量少、形成率低。菌龄过大，形成的原生质体少而且变形的多，有时甚至只产生菌丝碎片。以培养5-7天的菌丝制备的原生质体形成率高，活力大， 耐精制提纯。
②溶壁酶 单一酶对双孢蘑菇菌丝体去壁的作用不明显，多酶混合液的作用亦不理想。目前有效的均为木霉产生的酶系。我国广东省微生物所产的溶壁酶，丹麦产的Novozyme234等均属此类，但效果仍然有别。据报导， 复合酶系中若含过量的蛋白水解酶等会破坏细胞膜结构而降低原生质体活力，并影响到再生(Sonnenberg 等，1988)。
③稳渗剂 稳渗剂分无机和有机二大类。但同一类型中的不同种类对原生质体形成率的影响仍然很大，常用0.6MKCl，效果较好。
④酶解条件 适宜的条件是使溶壁酶处于最佳活力状态。由于加入的溶壁酶量大，故pH多保持自然，约5-6左右。温度偏低时，原生质体形成慢，反之快。 但温度偏高时，原生质体极易破裂，形成率反而下降，双孢蘑菇以２４℃为宜。酶解时间以2-4小时左右形成率高。时间短，形成率低，时间太长， 原生质体也易产生变形，活力下降，甚至破裂，形成率亦不高。推测酶解温度太高或时间太长均易破坏原生质体的膜结构，导致变形、破裂。
双孢蘑菇菌丝体酶解后，原生质体的释放不同步且形式多种。在显微镜下可观察到酶解时，菌丝体发生了质壁分离，其内含物剧烈收缩形成明显的边界，随着细胞质的流动逐渐从菌丝尖端或侧面释放出来，也有从菌丝片段断面释放出来，呈圆球状（图3-14）。原生质体大小相差较大(4-16微米)，尤其菌丝的菌龄较大时。偏大的原生质体多含大液泡，偏小的多呈透明状。无离子水低渗处理后，透明状的原生质体总是最先破裂，其次为含大液泡的原生质体，中等大小（８微米大小）且内含物较多的原生质体可以膨大数倍于原来的直径后才破裂。中性红染色时，中等大小的原生质体不易染上，表现出较强的活力。推测偏小的原生质体缺少细胞核或细胞内含物不完整，而偏大且含大液泡的原生质体可能是已发生某种不利的生理变化的结果。
图3-14 双孢蘑菇菌丝体制备原生质体(1.5%溶壁酶)
综上所述，以菌丝体为材料制备双孢蘑菇原生质体的适宜条件是取幼龄(5-7天)菌丝体加入0.6MKCl配制的1.5%溶壁酶(广东省微生物所产)pH5-6，于24℃下酶解2-4小时左右，原生质体形成率可达2.4×107/ml。原生质体大小较均匀，活力高(王泽生等，1990a)。另有报导，取４－５天菌龄的菌丝体，以0.6M蔗糖溶液为稳渗剂，加入由哈齐木霉Trichoderma harzianum ( TE) 的培养液溶液制备的溶壁酶在 2-4mg/ml浓度时溶壁活性高，原生质体产量可达1-2 × 10 7 / 克干重菌丝 ( A. S.Sonnenerg等，1988)。
2.2 原生质体再生
对食用菌原生质体融合育种来讲，重要的一环是必须使原生质体再生成具细胞壁的菌丝细胞。这样，才能对产生的同核体或融合子进行遗传鉴别，筛选与利用。
原生质体再生培养有液体和固体培养两种形式。一般食用菌多用固体培养基加上原生质体包埋（双层法）效果较理想，常用２％琼脂作包埋剂，双孢蘑菇原生质体再生也可用此法。福建省轻工业研究所所用的方法又有所不同。当获得精制提纯的双孢蘑菇原生质体悬液后即把该悬液稀释成105个/ml，加0.5ml 于液体再生培养基中培养(A)， 另取同量原生质体样品加数倍无离子水稀释后加入同一种再生培养基中培养(B)，分别在24℃下培养，定时取样镜检再生效果。再生率=(A的原生质体出芽数-B的原生质体出芽数)÷加入培养的原生质体数。取适量液体再生培养12-24小时的原生质体悬液涂布于固体再生培养基上继续培养10-20天， 当显微镜下观察到原生质体克隆再生成小菌落但尚未与其他克隆相连接时即用微型打孔器显微操作分离。可用菌丝生长速率、菌落形态、同工酶或核酸电泳等指标分析再生结果。
双孢蘑菇原生质体的再生受到再生培养基成份、稳渗剂种类与浓度、培养温度等因素的影响，甚至和制备时用的溶壁酶种类与浓度、酶解时间与温度条件等均有关系。有些溶壁酶系含有较多的蛋白水解酶，能破坏细胞膜结构而影响再生。酶解时间长或温度高虽然可以在一定程度上提高形成率，但原生质体活力受到影响，有些产生变形，甚至破裂，不利于再生。
①再生培养基 双孢蘑菇在常用的食用菌原生质体再生培养基上均难以再生细胞壁，而在特殊的蘑菇堆料培养基上才获得５％左右的再生结果（王泽生等,1990b,c）。这表明双孢蘑菇的细胞壁成份或结构与其他食用菌有较大差别，还表明蘑菇堆料中含有适于蘑菇再生细胞壁的某种成份。
原生质体于液体再生培养基上培养１２小时到２４小时，萌发出芽管后再涂布于固体再生培养基上培养比直接涂布培养更早出现肉眼可见的小菌落，这可能是液体培养状态更适于原生质体萌发出芽管的缘故。
②稳渗剂 不同的稳渗剂成份明显影响双孢蘑菇再生率，还影响原生质体再生的形态，不适宜的稳渗剂导致原生质体呈球状分裂，甚至不再生出菌丝体。
③显微观察 原生质体再生过程的显微观察结果表明，双孢蘑菇在液体或固体再生培养基上的再生形式相似。Ａ、再生不同步，快的１２小时后即萌发出芽管，２４小时长成菌丝(图3-15)，有的已分枝成小菌落状，慢的２４小时后才萌发出芽管。
图3-15 双孢蘑菇原生质体再生菌丝体(堆肥培养基)
原生质体再生的形态多种，有的萌发出芽管即长成菌丝，有的先分裂出一个近球状的细胞，由此再分出芽管、菌丝，也有的分裂成串珠状。当培养基成份，尤其是稳渗剂适宜时，再生形式以前两种为主。部分原生质体会不断膨大，胞内液泡也随之增大，尤其是稳渗剂不适时常发生。未见这种原生质体再生，时间延长多破裂。
④同核原生质体再生株 应用同工酶或核酸电泳技术分析可以发现一些双孢蘑菇异核菌株原生质体的再生株是单核或同核体(Castle等，1987;Sonnenberg等，1988)。王泽生等报导(1990)再生株酯酶同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳表型大多与亲本相同，属于异核体可育株，少部分再生株有区带缺失表现，与随机分离单孢子获得的同核体不育株的电泳表型相似。而且，再生的同核体与单孢子分离的同核体在生长速率与菌落形态上也有相同特点，即生长缓慢，菌落形态与正常的异核体菌株有较明显差异。这表明可以通过菌丝原生质体再生法获得同核体株用于常规杂交，而不必担心从担孢子分离的同核体因经历了减数分裂而可能发生某种遗传变异，或丢失亲本的某些优良基因(王泽生等，1989)。此法不必通过栽培收孢，因而又比用单孢子分离筛选同核体更快速、简便。但也有报导，经过原生质体再生的菌株由于曾经受过剧烈的环境压力（去壁过程等）而在菌丝生长或栽培中表现出某种不良性状 (Fritsche，1991)。用原生质体再生法获得双孢蘑菇同核体的频率一般为10%左右，高的可达30%(Castle等，1988;廖剑华等，1994)。
综上所述，双孢蘑菇原生质体再生的较适宜条件是在0.6M蔗糖的堆肥培养基上于24℃下培养10-20天。 液体再生培养基预培养后再涂布于固体培养基上能加快再生菌丝生长，再生率可达５％左右。
堆肥培养基配方为：堆肥75g，KH2PO42.0g，蔗糖20g，蛋白胨2g，NAA或KT2mg，MgSO4·5H2O0.5g，VB10.5g，壁制剂200ml，水800ml，pH自然。制固体平皿时加琼脂20g。壁制剂:称取静置液体培养的双孢蘑菇菌丝体400g，用0.6M稳渗液洗涤1- 2次，加500mlpH7.4，0.1M磷酸缓冲液，120℃灭菌30分钟，浓缩至300ml ， 匀浆，4000rpm离心，获提取液约200ml。
2.3 原生质体融合
双孢蘑菇杂交中有大约50%的组合因为细胞壁不亲和而无法杂交。 而且与其他食用菌相比，双孢蘑菇的种质资源显得十分贫乏，与亲缘关系相近的蘑菇种，比如大肥菇等的杂交也存在不亲和的问题，应用原生质体融合技术可以克服这些障碍。
常用的食用菌原生质体融合方法有化学融合法和电融合法。检出融合子常用的标记有生态学与形态学标记，有抗性或营缺型、同工酶或核酸电泳等遗传标记。福建省轻工业研究所采用含CaCl2的30%的聚乙二醇(PEG4000)，pH8.5作为融合剂进行双孢蘑菇原生质体融合。融合子经过0.6M甘露醇洗涤以去除PEG毒性后， 置于堆料再生培养基培养10-20天，把肉眼可见的小再生菌落分别移至新鲜的PDA培养基继续培养，凡菌丝生长速率恢复正常的分离株均选出作同工酶检测。用酯酶(EST)， 多酚氧化酶(PO)，细胞色素氧化酶(COD)，过氧化物酶(POD)和乙醇脱氢酶(ADH) 同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测融合子(王泽生等，1991)。凡电泳表型表现出杂合的或互补型的分离株被鉴定为融合株。融合率＝融合株数÷加入的原生质体数。
试验结果表明，双孢蘑菇原生质体在不同 浓度的PEG-Ca++系统中的凝聚速度不同。例如，当用30%PEG时，Ca++浓度太小，凝聚速度较慢，太大，速度快而且成堆结团。一般用0.02M的CaCl2较好(图3-16)，原生质体融合率可达10-5-10-6。 同
图3-16 双孢蘑菇原生质体融合(30%PEG-0.02MCa++)
亲本或不同亲本的原生质体融合子在堆肥培养基上均可再生。但是，通常只有不同亲本的原生质体融合成的异核体杂种株才可能恢复正常的生长速率。从再生培养15天左右的平皿上挑取的单菌落多属此类型。同工酶电泳检测结果表明，有的融合株明显具有双亲的标记酶位点，有的呈某一异核亲本的表型。与可亲和的单核菌丝配对杂交产生的杂种子一代(Wang等，1990)相比，同工酶表型更加多样，这可能是原生质体融合引起核基因组高频重组的结果。经栽培试验，结果表明，并非所有的异核体融合株均恢复结菇能力，这种现象与可亲和组合单孢株杂交的结果类似。它暗示细胞壁亲和性与结菇能力之间并无必然的关系，它们可能由不同的位点控制。恢复结菇能力的菌株，除部分畸形外，多数正常。有的融合株明显结合了双亲的某些特点。
电融合技术对原生质体损伤小、融合频率高，还能利用原生质体进行外源目的基因或细胞质成分导入即转化研究，为加速优良种质导入蘑菇提供了一条可能的途径。寻找新的种质，采用电融合技术进行双孢蘑菇与大肥菇种间杂交是福建省轻工业研究所主要研究内容之一。其目标是培育出抗蘑菇病毒、耐高温又保存双孢蘑菇风味的新菌株。
3.基因工程育种技术
基因工程是分子水平上的遗传工程。主要包括目的基因的标记与分离，目的基因与载体连接构建新的重组DNA，然后通过原生质体融合、转化、转导或DNA分子杂交技术等转移到受体细胞中进行正常的复制和表达，从而产生遗传物质和性状的转移和重新组合，获得人们所期望的新种。
当前，应用基因工程改良蘑菇品种的主要目标有三个。第一是提高对栽培基质的降解转化能力，提高单产；第二是改良蘑菇的抗病虫性基因，提高栽培品种的抗病虫害能力；第三是改良褐变基因，提高鲜菇保鲜能力。
应用基因工程改良蘑菇品种的技术、步骤如下：
⑴目的基因分离 分离基因的方法有理化方法或噬菌体摄取法，取得供体细胞内的“目的”基因，或用化学、酶促方法人工合成“目的”基因。
⑵目的基因的体外重组 这个过程需有两种酶的参与。一种为限制性内切酶，是一种水解DNA的磷酸二酯酶。目前主要用分子量小于10万道尔顿限制酶，在Mg2+ 存在下专一性强。另一种为连接酶，用于修复双链DNA分子上的缺口或裂口， 是通过合成邻近核苷酸之间的磷酸二酯酶链修复"缺口"或单链DNA的裂口。
重组过程是用特异的限制性内切酶切割供体及载体的DNA，所得的DNA片段通过粘接末端对应碱基间的氢键组合到一起，再经DNA连接酶的作用，将切口接合起来，成为一个完整的重组的DNA分子。
⑶载体传递 载体即运载基因的工具。体外重组的DNA 分子通过基因载体进入受体细胞，才能进行复制和表达。载体传递可以通过细菌质粒进行，也可以通过某些噬菌体、病毒或线粒体DNA进行。在大肥菇线粒体中发现有类质粒DNA(pl-DNA)，但在蘑菇中尚未发现，目前有人探讨利用蘑菇线粒体DNA作为载体。
⑷转化 有些蘑菇育种者利用基因枪或原生质体电融合等技术把目的基因片段不植入载体而直接转入受体细胞中进行外源基因表达。
⑸复制、表达 基因工程的最后一个关键在于“目的”基因(重组DNA或外源DNA)在受体细胞中能复制而扩增，表达出新的遗传性状。
⑹新菌株筛选 重组基因所表达出的新性状是否符合要求需要做大量的筛选工作，从大量个体中筛得具有理想性状的个体，才能加以繁殖和利用。
4.双孢蘑菇育种可利用的其他种质
蘑菇属中许多种产生的子实体与双孢蘑菇相似，其中大肥菇(Agaricus bitorqus)最为接近。大肥菇的担子上能产生４个担孢子，亲和性受单因子控制， 是异宗配合的种。因此，它的单孢子培养物是自体不育的，在它们之间进行杂交很容易，由于容易操作，就有可能在较短时间内改良品种。大肥菇野生菌株间存在着巨大的变异，可供利用。另外，大肥菇能在20-30 ℃的高温下结菇而且能抗双孢蘑菇病毒的侵染，假如能把大肥菇的这二个特点结合在双孢蘑菇上，育出的新品种将极大地提高双孢蘑菇的耐高温和抗病毒侵染能力。
此外，Frische(1979)研究过野蘑菇(A.arvensis ) 获得一些进展。 Elliott(1979)阐述了大孢蘑菇(A.macrosporus)和雪白蘑菇(A.nivesceus) 都是具有单交配因子、异宗配合的四孢种。大孢蘑菇在栽培双孢蘑菇的条件下可以结菇。
原生质体融合技术和基因工程技术为其他种质的利用提供了有效的手段。
5.双孢蘑菇重要标记位点研究进展
5.1 与双孢蘑菇交配型性因子和子实体产生相关的标记位点
在改良双孢蘑菇菌株的特性之前，先了解其生殖体系及其遗传基础是十分必要的。遗传学家们应用了营养缺陷型突变标记，抗药性突变标记、同工酶标记与 DNA标记等进行研究，结果认为：双孢蘑菇的性特征是属于无锁状联合的次级同宗配合类型，担孢子通常是自体可育的； 双孢蘑菇的性因子属于二极性， 由一对性因子A1A2控制。进一步的研究表明，双孢蘑菇的性因子可能存在 A3A4 等复等位基因 (Raper 等,1972;Elliott 1979;Wang 等,1990)。性因子决定细胞壁的亲和性但并不保证子实体的发动(Esser，1979;May 等,1982;Wang等,1990)。1990 年加拿大多伦多大学生物系Anderson教授实验室开展了染色体与DNA水平上的探讨， 已把配合型性因子基本上定位在第I条染色体上， 并进一步作配合型性因子与子实体发动基因的定位，计划把这些基因克隆出来做分子遗传研究(Xu,加拿大，1990，私人通讯)。此外，Harmsen等(1991)，Wassels(1991)还分别对双孢蘑菇2个连锁的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因与发育中的疏水基因进行了分离与研究。国内在DNA 水平上的研究刚刚起步。在其他食用菌方面，Meinhardt等人( 1981) 报导了杨树菇 ( Agrocybe aegerita)与子实体发动、发育有关的基因Su，fi和fb的研究结果。Raper等(1991)报导了一个诱导裂褶菌子实体发育的DNA序列。Shishido(1992) 报导了与香菇结实性相关的基因结构与功能。总之，在基因水平上的研究仍属探索，但可望在不久的将来有较大的突破。
5.2 与双孢蘑菇降解基质能力相关的标记位点
一个菌株降解基质的能力直接影响到其产、质量性状的表现。双孢蘑菇降解基质的重要酶类，木质素酶（漆酶等），纤维素酶位点始终是蘑菇育种家与生理生化学家研究的重点。先前，已有人应用遗传型差异与降解基质能力的大小评价菌株的优劣(Kulkarn等，1989)。英国温室作物研究所克隆了双孢蘑菇的产漆酶基因， 并试图把抗病虫害基因，降解基质的纤维素酶基因，与保鲜相关的基因，分离鉴定出来并用于转化育种(Elliott，1988)。
5.3 与双孢蘑菇产质量性状相关的标记位点
寻找能预测新菌株产质量性状的标记位点，无疑是蘑菇育种家的重大课题，它不仅能使育种家从成千上万个新菌株中快速识别出可能的优良菌株，提高育种效率，并能为目的基因的确定与克隆奠定基础。除了降解基质的木质素酶、纤维素酶位点与菌株产质量性状相关外，还有一些重要的酶类，比如双孢蘑菇的酯酶(EST)、 乙醇脱氢酶(ADH)、多酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、细胞色素氧化酶(COD) 同工酶与水可溶性蛋白，这６个生化标记已被证明与不同类型菌株的产质量性状明显相关(Wang等，1989a，b)。在有性繁殖的单孢子代中可以发现，产质量性状发生变化的单孢培养物，其同工酶电泳表型也发生了改变。这些电泳表型因而被命名为H 型或高产类型，G型或优质类型，HG1-2型或中间类型，S型或不育类型。这些酶当中，已知多酚氧化酶、过氧化物酶和细胞色素氧化酶与木质素降解或子实体褐变有关，而酯酶与乙醇脱氢酶在影响产质量性状中的作用机制，国内外食用菌界均正在研究之中(Xu等，1990，加拿大私人通讯)。尽管如此，在进一步分析HG4-5 型杂交种的单孢子代后，发现上述6个生化标记，尤其是酯酶的标记区带(Wang等，1989) 的基因基础可以被推定。测算出子代中标记位点间重组的频率，完成了标记位点EstA，B与C在染色体上的定位(Wang等，1991)，为定向育种提供了理论预测与指导依据。此外，方自若等(1990)探讨了胞内核质对金针菇同工酶标记位点的影响。朱坚等 (1990)试图寻找早期鉴定高产、抗病、 色浅与质脆的金针菇优良后代的生化标记。三明真菌所王芳辉等(1991)，开展了与香菇某些生长特征相关的同工酶研究。李家慎等(1989)，王泽生等(1992)，张金霞等(1992)探讨了与草菇种性相关的同工酶类。荷兰的Neut(1991)也用酯酶把双孢蘑菇分为白色品系、米色品系、Horrouda杂交品系和HorWitu杂交品系四大类型，并用作育种的检验指标。 除了双孢蘑菇的同工酶标记位点产物类型已被应用于实际育种中外，其他均处于探索阶段。
5.4 与双孢蘑菇褐变或风味相关的标记位点
几乎所有的食用菌子实体都是生长快速而又容易腐败的，双孢蘑菇也不例外。因而，蘑菇栽培者与加工厂商都希望育种家为他们提供不易褐变、风味好、保鲜能力强的优良品种。早先，只能单纯依靠栽培来筛选菌株，需花费巨大的人力、物力、财力。后来引入了同工酶等生化标记(Wang等,1989a,b,1992) 以防止栽培生产中使用不符合鲜销或制罐要求的易褐变或易腐败的菌株。1988年始,美国的Monterery研究室的Wach等将荷兰育种家Fritsche育成的杂交种U1的DNA片段导入大肠杆菌， 建立起基因文库，并尝试把某些DNA片段导入其他菌株， 以期育成不因机械伤而发生褐变的优良菌株。1991年，Khush等应用PCR技术扩增重要的DNA片段， 对能催化褐变的双孢蘑菇酪氨酸酶的基因作了研究。
5.5 食用菌基因组文库的建立
食用菌基因工程研究的另一内容是通过提取菌株的高分子量总DNA， 经酶切和电泳或密度梯度离心，获得一定长度(Kb)的总DNA酶切片段，以细菌质粒等为载体，经过酶连形成重组DNA，再转入受体菌中构建为基因组文库。 进一步应用分子杂交技术，从文库中筛选特异性基因（目的基因），再应用于食用菌遗传育种等研究之中。八十年代始，国内外开展了这方面的工作。如Esser等于1983 年提出利用线粒体DNA或者类质粒作为真核细胞的载体。Elliott和Noel等(1987)建立了双孢蘑菇和杨树菇的基因文库。Challen等(1991)提出了双孢蘑菇转化的策略。Koyer等(1991)展望了双孢蘑菇转化系统的现状与未来。吕作舟等(1992，1993)报导了平菇基因组文库的构建。此外，裂褶菌与鬼伞类的基因组文库也被构建起来。
对双孢蘑菇遗传生活史及其基因基础的认识，从个体水平，细胞水平，提高到分子水平，使我们能够把它们与配合型性因子，控制子实体发动、发育，控制降解基质能力，与产质量性状相关或影响子实体褐变，风味的重要标记位点作为目的基因来进行研究。上述四个方面，只要任一方面获得突破性进展都将把双孢蘑菇的育种技术真正提高到分子水平，对改良菌株特性，提高生产的经济效益都将产生重大的影响。
6.染色体组型分析及遗传连锁图的建立
脉冲电泳的发明使得分离染色体、 分析核型成为可能。 Royse( 1991) ，Sonnenberg(1991)，Lodder(1993)先后将这项技术应用于双孢蘑菇的研究，并且进展很快。应用Novozyme234制备原生质体的得率可高达1.6-6.7×109/g干菌体， 满足进行脉冲电泳的制样需求。在各项参数被优化后的电泳条件下，双孢蘑菇的核型在电泳胶上表现为11个条带，分子量分布在1.1到5.7，基因组总长约34Mb，进一步进行Sorthern杂交则确证双孢蘑菇染色体一共有13条。早在1959年Evans 也曾通过染色镜观察，估计染色体有9条。
双孢蘑菇的染色体组型，在各菌株间呈明显多态，并且遗传物质在杂交子中是非等量混合的。Kerrigan还发现同核株的菌丝活力往往与一定染色体片段相关联。应用脉冲电泳分离双孢蘑菇的染色体，配合分析各标记在亲本及其子代中的分离情况，Kerrigan于1993年建立了包括同工酶、RFLP、RAPD、rDNA重复序列以及少量外部表型性状等多种标记的遗传连锁图。混合标记连锁图的建立为今后进一步分析双孢蘑菇的遗传行为，定位克隆有关基因提供了一个很好的参照标尺。
脉冲电泳在双孢蘑菇遗传研究中的最新发展是1996年Sonnerberg将从cDNA文库中分离得到的表达序列标记(ETS)定位于双孢蘑菇相应的染色体上，其中包括ATP合成酶、漆酶、纤维素酶等已被克隆测序的与双孢蘑菇菌丝的生理生化特性相关基因。Sonnerberg的研究取材为U1菌株的两个同核双亲。研究发现rDNA在染色体中拷贝数的不同可导致相同的染色体的长度在不同菌株中发生变化。这是染色体组型在菌株中呈现多态性的原因之一。表达序列标记及某些功能基因的定位有利于今后对这些基因的表达、调控作进一步深入的研究。
7.mtDNA的遗传研究
线粒体DNA(mtDNA)是真菌中最主要的染色体外遗传物质，遗传方式独特。该遗传系统虽受控于核系统，但仍存在特殊的DNA复制机制，RNA拼接机制以及个别有别于"通用"密码子的遗传密码子。
对双孢蘑菇mtDNA的研究始于1988年，此年Hintz构建了双孢蘑菇的mtDNA 的物理图谱。发现的双孢蘑菇的大小为136Kb，是在真菌中发现的分子量较大的mtDNA。从得到的酶谱来看，线粒体基因组也同其它的真核生物(尤其真菌)一样大致可分为可变区与保守区，但mtDNA的编码能力稳定， 在种间及种内显现多态性的原因主要在于基因组内含子数量的变化。另外，所有mtDNA中均存在反向重复序列， 此类序列有时双向存在，暗示双孢蘑菇mtDNAA 中存在转座行为， 从而导致分子内重组 (Sonnerberg等，1991)。
尽管双孢蘑菇mtDNA在种内存在多态性， 但由于双孢蘑菇保守的遗传机制以及长期以来在栽培中标准单一的人工筛选， 其多态性明显不如其它许多物种显著。Sonnerberg等用限制性酶切产生多态酶谱的方法发现三种mtDNA ， 即使后来 Jin(1992)再用RFLP标记探针杂交，也仅能区分出四种mtDNA，这是双孢蘑菇种质危机的另一体现。
mtDNA的遗传是单亲遗传，不同线粒体DNA的同核株的杂交子只承袭其中一个亲本的基因型，而且往往是生长得较快亲本的线粒体基因型。但如果让生长较慢的同核株先生长一段时间后，再与生长较快的同核亲本杂交，则在菌丝的融合区可分离到包含两亲本线粒体基因型的异核子代， 在子代中两亲本的胞质分配不均是造成mtDNA单亲遗传的原因之一(Jin，1994)。杂交子中极少发现有重组型线粒体DNA ，但重组型线粒体DNA可在原生质体融合株中发现，因为电融合导致线粒体融合。 所以从育种角度来看，原生质体融合比单孢杂交更易产生新种。
不同的线粒体DNA之间未发现有明确的显隐性关系， 但以上提到的菌丝融合区分离到包含两亲本基因型的异核子代在充分生长后，其中之一的线粒体基因型会丢失。至今没有很好的假说来解释这一现象，Sonnerberg(1991)曾经提出不同核/ 质组合可能存在显隐性关系的假说。
8.双孢蘑菇转化育种研究进展
双孢蘑菇育种实践呈现两大趋势，一是筛选同核单孢或原生质体进行杂交，期望通过具抗逆性较强或其它优良性状的野生株与"近乎纯种"的商业株之间的杂交来提高生产用种的种性，因此发现更多的野生种质形势迫切。另一趋势则是运用原生质体为DNA片段的受体细胞进行转化育种。事实上， 转化比杂交可更直接地对双孢蘑菇的基因组进行改造，这种改进双孢蘑菇农学性状的方法目的性、选择性更强。原生质体阳性转化，一般通过营养缺陷互补，表型互补或显性标记的方法进行选择。但双孢蘑菇的营养缺陷型突变株很难获得，而且突变子由于生理上的缺陷，生长缓慢，培养困难。因此，以抗药性作为显性标记是转化实验中较受青睐的方法。
技术上外源DNA片段导入原生质体的手段包括⑴PEG/CaCl2介导;⑵LiCl 介导，但该法的转化效率不如PEG/CaCl2介导法;⑶电转化;以及⑷用基因枪将DNA直接射入原生质体。
Sorthern分析和亚克隆试验表明，大多数丝状真菌的转化为整合转化，而且转化DNA整合不需要广泛的序列同源性。整合有同源重组和非同源重组两种类型。 然而，在双孢蘑菇中，正如以往的研究发现的，重组行为极少在该物种中发生，无论是核基因组还是线粒体基因组。因此，90年代初期进行的双孢蘑菇原生质体转化实验鲜有成功的报导。当然，当时这方面的转化技术尚不完善，采用的是效率相对较低的PEG/CaCl2DNA片段介导法，而且连接大肠杆菌的抗潮霉素转化载体的pAN7启动子是来自非蘑菇属的曲霉。
到了90年代中期，荷兰的Van de Rhee 的努力使原生质体转化研究有了较大进展。虽然转化子选择标记仍以潮霉素(hygromycin)抗性作标记，但此时的转化载体已有了双孢蘑菇的启动子Abgpd2，终止子为pA2H或pA2H-T1，转化方法改用电转化,载体在转化前用单切酶切成线状，提高了转化的效率。Van de Rhee 等人还曾尝试将造成双孢蘑菇褐变的酪氨酸基因的反义DNA 序列与潮霉素抗性基因进行共转化，以期抑制子实体中酪氨酸酶的活性，达到保鲜的目的。结果在转化株的子实体中用探针仍可检测到稳定存在的导入DNA片段。
一个有价值的双孢蘑菇的转化株的获得必然包括三个技术环节，外源DNA 片段的成功导入;该片段在受体细胞中的稳定表达;以及该基因控制的性状在子代中的稳定遗传。但目前为止，外源DNA在受体细胞中的稳定表达还很难做到， 而且克隆到的直接控制双孢蘑菇表型性状的目的基因为数甚微。因此，双孢蘑菇的转化育种研究仍有许多工作要做。
（八）双孢蘑菇商品杂交菌株简介
目前全世界使用的双孢蘑菇菌种有90%以上均为同核不育单孢杂交的菌株。 从颜色上分，有白色杂交种（多为纯白种与米白色种杂交）和棕色杂交种（多为棕色种之间或棕色与白色种之间杂交）。从生产特性上分又有适于工厂化生产的种（如U1系列）或适于自然气候条件下栽培的种（As2796系列）。从加工特点上分，又有适于鲜销的种(S130),适于罐藏加工的种及二者都适用的种(As2796)。 现将在我国已被试种过的几种杂交菌株介绍如下。
表3-5 双孢蘑菇部分商品杂交菌株简介
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国别 选育单位 菌株名称 EST同工酶类型 使用情况
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中国 福建省蘑菇 As2796 HG4 在中国广泛使用，抗逆性
菌种研究推 As3003 HG4 强，鲜菇适用于罐藏或鲜
广站 As4607 HG4 销。
荷兰 Horst蘑菇 U1 HG4 在欧洲，北美广泛使用，适于
试验站 工厂化栽培，或罐藏或鲜销
美国 Sylvan公司 S130 HG4 适于工厂化栽培，鲜销
S608 HG4 适于工厂化栽培，鲜销
S512 HG4 适于工厂化栽培，罐藏与鲜销
法国 F56 HG4 在欧洲广泛使用，罐藏与鲜销
F50 HG4 在欧洲广泛使用，罐藏与鲜销
