双孢蘑菇丛生变异分子机理的初步研究
王泽生 陈美元 廖剑华 卢政辉 郭仲杰 李洪荣
(福建省轻工业研究所, 福州, 350005)
摘要：以双孢蘑菇正常菌株及其丛生变异菌株基因组DNA为模板，通过大规模的RAPD扩增，找到一个随机引物U18，能区分正常及丛生菌株。将丛生菌株特异片段制成探针，Southern杂交表明该片段在双孢蘑菇基因组中为单拷贝序列。纯化该片段并克隆到pUC-T质粒中，序列测定表明该片段长735bp，GenBank查询结果表明该片段编码了二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH)C末端173个氨基酸。
关键词：双孢蘑菇 丛生变异 分子机理 RAPD DLDH
双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是世界上栽培最多的一类食用菌。在人工栽培中，其子实体正常的生长形态为单生，菇形圆整。丛生即几个子实体聚集而生，菌柄相连结，是双孢蘑菇的一种异常生长形态。丛生变异的菌株表现为大部分子实体丛生，菌盖因相互挤压而变形，产生大量的畸形菇，降低了其商品价值。丛生在国内的蘑菇栽培中较为少见，而在国外的机械化栽培中较常见，其原因尚未明了，但前期研究表明引起丛生的原因是菌株自身的变异而非栽培条件。由于丛生变异只表现于子实体，在菌种阶段并无异常，故难以早期预测。国外的蘑菇菌种公司及栽培农场每年因丛生造成的经济损失曾高达数百万美元。目前世界上有好几个实验室从基因组DNA、RNA、mtDNA等不同角度探索双孢蘑菇丛生变异发生的内在因素。我们从基因组DNA的RAPD着手，对该变异的分子机理作了初步研究。
1 材料与方法
1.1 菌株: 双孢蘑菇正常菌株AA,GG及其丛生菌株(由发生丛生变异的子实体中组织分离获得) A34,A35,A41,G26/1/2由美国Sylvan公司提供，现保存于福建省蘑菇菌种研究推广站。
1.2 试剂: Dig标记与检测试剂盒、尼龙膜购自宝灵曼公司, 其余试剂购自上海生工公司。
1.3 方法：
1.3.1 基因组DNA提取、PCR、RAPD分析按以前的方法[1]。
1.3.2 探针制备: 以Dig-dUTP代替dTTP, 用PCR方法制备标记探针。
1.3.3 Southern杂交: 电泳胶经EB染色照相后, 进行脱腺嘌呤及变性处理[2], 再通过真空转移将DNA转至尼龙膜上。使用Dig标记与检测试剂盒, 按照厂家提供的方法进行非放射性Southern杂交及显色。
1.3.4 目标条带的纯化与克隆[3]：用低熔点琼脂糖法对目标条带进行纯化后连接到载体 pUC-T质粒中, 转化大肠杆菌JM109, 通过蓝/白法筛选克隆子, 并用双酶切和PCR方法进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 RAPD分析:
以双孢蘑菇健康菌株AA、GG及其对应的丛生变异菌株A35、A41、G26/1/2等的菌丝体基因组DNA为模板, 使用75个随机引物进行RAPD扩增, 发现有4个引物在不同程度上表现出健康与丛生菌株的差异，其中引物U18能很好地区分正常与丛生菌株。从图1中可以看出, 在接近800bp处, 正常菌株只有一条带，而丛生变异菌株除了产生该条带外，还多出一条约750bp条带。
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图1 随机引物U18对双孢蘑菇正常及丛生菌株的
RAPD扩增图谱
Fig.1 RAPD pattern of healthy and clustered strains of
Agaricus bisporus amplified by the random primer U18
M道: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; 1-5道:菌株
AA, A35, A41,GG, G26/1/2总DNA的RAPD带型。
←800bp Lane M: λDNA/EcoRI+HindⅢ Marker; Lane 1-5:
RAPD band patterns of the total DNA of AA,A35,A41, GG,
G26/1/2.
2.2 探针制备及Southern杂交
以消毒牙签刺取凝胶中A41的差异带作为模板，用U18引物通过PCR方法制备差异片段的Dig标记探针，标记的探针初步定量为20～30ng/ul。用该探针对A41、AA总DNA的 EcoRI或BamHI酶解产物进行Southern杂交，均只产生一条信号较强的杂交带。该结果表明该片段在双孢蘑菇基因组中为单拷贝序列(图2), 说明它可能是某个特殊的基因片段，这给我们提供了进一步研究的可能。
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图2 用丛生特异探针对双孢蘑菇基因组DNA的Southern杂交图谱
Fig.2 Southern blotting pattern of genomic DNA of A.bisporus with cluster-special probe
1-6道: A41总DNA/EcoRI; AA总 DNA/EcoRI; A41总DNA/BamHI; AA总DNA/ BamHI; AA总DNA; 阳性对照.
Lane 1-6: A41 total DNA/EcoRI; AA total DNA/EcoRI; A41 total DNA/BamHI; AA total DNA/ BamHI; AA total DNA; Positive Control.
2.3 丛生差异带的纯化与克隆
丛生菌株A41 750bp处的RAPD差异条带用低熔点琼脂糖法加以纯化，经电泳验证后克隆到PCR产物克隆专用载体pUC-T质粒中。用蓝/白法从三个培养皿中共筛选到45个白色克隆子, 经酚/氯仿快速裂解并电泳鉴定后获得两个预期大小的克隆子, 编号为No.2和No.14。进一步用U18引物对这两个克隆子进行PCR扩增, 发现No.14克隆子扩增出750bp条带。用EcoRI和HindIII进行双酶切分析, 结果显示No.14克隆子切出了750bp条带（因其带部分载体序列，实际长度约800bp）。以上结果表明No.14克隆子已成功克隆到了显示丛生差异的目标条带（图3）。
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图3 克隆子的PCR(引物U18)及双酶切(EcoRI+
BamHI)鉴定
Fig.3 Determination of the recombinants by PCR
(with the primer U18) and double-enzyme (EcoRI+
BamHI) digestion
1-3道: 质粒pUC-T,克隆子No.14和No.2的PCR
←800bp 带型; 4-6道: 质粒pUC-T,克隆子No.14和No.2的双
酶切带型; M道: 100bp DNA ladder
Lane 1-3: PCR band patterns of plasmid pUC-T,
recombinant No.14 and No.2; Lane 4-6: Double-
enzyme digestion patterns of pUC-T, recombinant No.14
and No.2; Lane M: 100bp DNA ladder
2.4 克隆条带的序列测定及分析
根据pUC-T载体上的测序位点, 用M13正反向引物对克隆条带进行序列测定。测序结果表明该片段长735bp(含两端随机引物)。把该序列转为其mRNA序列, 通过Genbank查询发现, 从mRNA的5’端开始, 该序列编码了一个部分开放读框(ORF), 即二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLDH) C末端的173个氨基酸。编码序列有2或3个移码：一个大约在210～215位置，一个在400～460之间（与其它真菌序列相比，双孢蘑菇在此处有一20个氨基酸的非线性整合），可能还有一个在大约35位置。该ORF中剩余的下游215个碱基在Genbank中未找到明显的同源序列。
3 讨论
3.1 通过大量的RAPD实验, 我们筛选到了U18引物, 能较好地区分双孢蘑菇正常菌株及其丛生变异菌株, 为双孢蘑菇丛生变异在菌种阶段的早期预测提供了一种DNA水平的标记。但由于RAPD标记不够稳定, 要将其应用于生产，还需获得更多的丛生变异菌株进行试验, 以验证该标记与丛生变异的相关性。
3.2 克隆序列编码了DLDH C末端的173个氨基酸, 该脱氢酶是线粒体基质中的一种核编码蛋白, 在细胞呼吸中起着重要作用, 不少重大的遗传疾病都与该酶的遗传缺陷有关。本研究结果表明了一种可能性, 即丛生变异可能与呼吸途径有关，但这需要大量的实验来论证。
3.3 在下一步的研究工作中，我们将研究在正常与丛生菌株中DLDH基因表达产物的差异，即DLDH酶蛋白活力的差异和mRNA的差异。如有必要，将构建两类菌株的基因组文库或cDNA文库，争取获得两类菌株完整的DLDH基因序列，通过构建限制性酶谱或序列分析等手段，确证该基因与丛生变异的相关性，最终阐明双孢蘑菇丛生变异的分子机理。
参 考 文 献
1 陈美元,廖剑华,王泽生. 双孢蘑菇三种类型菌株的RAPD扩增研究. 食用菌学报, 1998, 5(4):6-10.
2 路建平主编, 非放射性杂交技术. 海口:南海出版公司, 1996:31-40.
3 J萨姆布鲁克,E F弗里奇,T曼尼阿蒂斯著(金冬雁等译). 分子克隆实验指南(第二版). 北京:科学出版社, 1995:672-683.
A Preliminary Study on the Molecular Mechanism
of Clustering Variation of Agarucus bisporus
Zesheng Wang Meiyuan Chen Jianhua Liao Zhenghui Lu Zhongjie Guo Hongrong Li
(Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005)
Abstract: Using the genomic DNA of healthy strains and their clustering variation ones of A.bisporus as templates, a large scale of RAPD amplification was performed, and a random primer U18 was found to be able to distinguish the healthy and clustered strains. The probe was prepared with the cluster-special fragment. The result of Southern blotting suggested the fragment to be a single copy sequence in the genome of A.bisporus. The DNA fragment was purified and cloned into pUC-T plasmid. Sequencing result showed that the fragment has a size of 735bp, and encodes the C-terminal 173 amino acids of dihydrolipoamide dehydrogenase (DLDH).
Key Words: Agarucus bisporus, Clustering variation, Molecular mechanism, RAPD, DLDH
