双孢蘑菇的遗传和育种
A.S.M.Sonnenberg，荷兰霍尔斯特蘑菇试验站
陈美元译自《Mushroom Science》15(1): 25-39, 荷兰, 2000.5,王泽生校。
摘要：在过去几十年里选育双孢蘑菇的成果甚为匮乏。自从1980年育出第一个杂交种以后便没有真正的新菌株问世。然而，人们已经在生活史、遗传变异来源的可利用性以及育种的有效工具方面获得了许多进展，这些都是产生新菌株的前提。本文回顾了这些前提条件的发展情况，着重论述新的进展。
1 前言
直到最近几十年双孢蘑菇的生活史才被完全揭开，显示出在育种上的潜在价值。但从那以后，关于育种程序的报道却很少出现。从通过育种获得第一个杂交菌株并推向市场以后至今，二十年已经过去了。现在，多数菌株要么与第一个杂交种相同，要么非常接近。（译者注：此结论有失偏颇，比如我国于89年育成的杂交新菌株AS2796经美国Sylvan蘑菇公司鉴定，认为在遗传、栽培特性与质量性状等方面与U1系列都有显著的差异。）虽然新的杂交种在产量的提高上有所贡献，但世界性的生产发展却是由于其它原因，即栽培面积的增加、栽培技术的完善、添加剂的使用和堆料的改进。
有人将因此认为回顾双孢蘑菇的育种不是一个艰巨的任务。但这些印象在某种程度上是不真实的。虽然最近没有真正的新菌株出现，但研究工作已取得相当大的进步，使得新菌株看来象是很快就会出现。因此，本篇主报告将重点论述与育种、育种技术及育种战略有关的遗传学新进展。
选育新菌株的前提条件是：1）生活史的知识，2）作为变异来源的菌株的收集，3）有效的育种方法，包括评定感兴趣性状的可靠且快速的方法。新菌株缺乏的主要原因是过去这些条件都没有得到充分满足。尤其是双孢蘑菇具有独特的生活史，它妨碍了有效的育种并限制了菌株的遗传多样性，成为影响育种的主要障碍。我将尽量回顾有关论文的关键内容并强调最新进展。
2 双孢蘑菇的生活史
双孢蘑菇的生活史在过去已得到很好的研究（Raper et al.,1972;Elliott,1972）。菌株的亲和性由一个交配型因子控制，可育性需要不同的等位基因。可育的无性菌丝体由一个细胞网络组成，每个细胞含有不定数量的两种不同遗传型的核，具有相反的交配型（异核体）。在担子，即菌褶上能产生孢子的特化细胞中，核的数量减为两个，每种交配型各一个。核融合后进行正常的减数分裂，大部分担子产生两个孢子，每个包含两个非姐妹核(n+n)。出菇试验表明这些单孢培养物能够产生子实体，即它们都含有两种交配型。除了这种交配型基因的异等位现象，双孢蘑菇看来通常还保留了其亲本的异质性(Royse & May,1982; Summerbell et al.,1989)。这可以这样解释：假定有一个机制偏爱非姐妹核的配对，那么减数分裂中就存在一个低重组率。前者由Evans(1959)的显微观察所支持，镜检显示减数分裂纺缍体形成的结果是孢子的80%结合了非姐妹核。多个报道也表明双孢蘑菇存在一个反常的低重组率(Royse & May,1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993)。只有少数担子产生3或4个孢子，这类孢子的大部分是单倍体(n)，不结菇或只产生有限数量的子实体。这类孢子的单孢培养物产生的无性菌丝体，每个细胞（同核体）也包含数量不定（遗传相同）的核。这种次级同宗配合生活史在所有的商品菌株和来自Alberta、加利福尼亚海岸及法国的野生分离株中均有发现(Kerrigan,1996)。双孢蘑菇的其它特性是，除了同核体和异核体中不定数目的核以外，异核体中还缺乏锁状联合。独特的生活史及同核体和异核体间缺乏差异成了育种的一个严重的障碍。
最近，加利福尼亚发现了一个四孢担子占绝对优势的稀有类群(Callac et al.,1993)。多数单孢培养物同核且不育表明它们的生殖方式是异宗配合。该类群与商业及野生分离的双孢菌株均可相互杂交。遗传分析表明该四孢种和双孢种间甚至存在着保守的遗传连锁，也就是说，二者基因组标记的位置和序列相类似(Callac et al.,1997)。由于生殖方式的差异，进行了一次品种身份测试，即双孢蘑菇与四孢蘑菇杂交（异宗配合）对双孢蘑菇与双孢蘑菇杂交（次级同宗配合）。四孢种产生同核子代表明其繁殖方式趋于远系繁殖。观察到的结果支持了这一点，即四孢变种和双孢/四孢杂交种减数分裂的重组率要高于双孢蘑菇(Callac et al.,1997; 1998; Sonnenberg et al.,1996b)。Imbernon等人（1996）已把决定担孢子数目的遗传因子初步定位于染色体I上，最近研究结果表明该决定因子的四孢等位基因也存在于一个法国类群(Callac et al.,1998)。品种间杂交育种表明四孢表型是显性的，具有多样的渗透性(Imbernon et al.,1996)，因此能转移到商品菌株上。这无疑将推动育种的进程。
所获得的生活史及遗传方式的知识表明育种前提条件之一已得到满足，双孢蘑菇的育种具备了很好的可能性。
3 新种质
直到70年代后期，靠机率筛选仍然是改良菌株的主要手段。Royse 和May（1982）查明所搜集到的商品菌株的遗传表型数目非常有限。虽然存在这个缺点，Fritsche还是把这些传统栽培菌株应用于有较大风险的育种计划之中(Fritsche,1984)，最终育成第一批杂种（Horst U1和U3）而闻名世界。然而，使用同样的传统菌株作进一步的育种努力却没有获得任何新菌株(Fritsche, 未发表结果)。大部分当今的杂交菌株要么与这两个杂交种相同，要么非常相似(Loftus et al.,1988; Sonnenberg et al.,1999; 本文)。Royse 和May(1982)以及Kerrigan(1990)已查明，双孢蘑菇栽培菌株和收集的培养物表现出较低的遗传变异性，这些保存菌株的大部分可能来自不到20个的欧洲独立菌株。育种对变异来源的需要及加利福尼亚非欧洲种质的发现(Kerrigan & Ross,1989) 使促进双孢蘑菇新种质发现、描述、保藏的蘑菇属种质工程（ARP）得以启动（Kerrigan,1996）。自从ARP菌株1995年放开以后，现在很多育种小组都在使用它们。ARP菌株中的遗传变异与栽培或传统菌株中的遗传单一性具有很大的不同(Kerrigan,1995; Sonnenberg et al.,1999;本文)。这些菌株还展示了当今杂交种中未发现的许多令人感兴趣的特性。已有报道表明一些野外收集菌株对白色双孢蘑菇栽培中已知的三种主要的病原菌（图1）表现出低敏感性或抗性。例如Dragt等人（1995）描述了ARP中的两个菌株对干泡病的病原菌菌生轮枝菌具有部分的抗性。这些菌株的低敏感性结合农场严格的卫生条件足以防止大规模干泡病的暴发。在栽培品种中导入部分抗性也能降低杀真菌剂特别是施保功和百菌清的使用。
图1 蘑菇生产中的三种主要病害。A：干泡病（真菌寄生轮枝菌）；B：法兰西病毒病（双孢蘑菇病毒）；C：细菌性斑点病（托拉斯假单胞杆菌）
另一种能在蘑菇生产中造成相当大损失的病害是托拉斯假单胞杆菌引起的细菌性斑点病(Raniey et al.,1992)。Olivier等人（1997）应用一种标准方法评估双孢蘑菇菌株对斑点病的抗性，并在法国野生类群中发现数量可观的野生菌株对该病表现出低敏感性。
食用菌中唯一研究较多的病毒病是双孢蘑菇病毒病或法兰西病(Van Zaayen,1979)。该病毒的基因组已被分割并发现它由至少10段主要的dsRNA构成（Harmsen et al.,1989）。ARP菌株中没有显示法兰西病典型的dsRNA带型。许多ARP菌株有新的带型，表明存在新的病毒类型(Sonnenberg et al.,1995)。然而大部分ARP菌株似乎没有dsRNA。当用感染病毒的商品菌株同核体与没有病毒的野生菌株的同核体杂交以转移法兰西病的病毒时，发现了令人感兴趣的结果。许多杂交种保留了病毒的dsRNA，但有时没有或几乎没有任何症状(Sonnenberg et al.,1995)。而更令人感兴趣的是有的杂种不能通过这种途径感染，重复的尝试也无济于事。这些结果表明一些ARP菌株可能对商品菌株病毒病具低敏感性和/或抗性。
发现商品菌株的许多栽培特性会发生变化(Sonnenberg et al.,1996b)。这些特性是走菌时间或通风诱导后的菇蕾形成时间。蘑菇栽培的最适温度也会变化。上述表明第二个前提条件即育种变异来源的可利用性也已得到满足。
4 遗传标记的发展
在过去的20年里向前迈出的重要一步是遗传标记的发展和应用。在探索双孢蘑菇的遗传构成，了解它的遗传方式，获得更多对菌株起源及其相互关系的认识等方面，这些标记已变得非常重要。首先，这些标记在任何育种工程中已成为不可或缺之物。标记可以预测某些遗传因子的遗传方式，这些遗传因子或与性状相关，或与包围它的区域紧密连锁。这使得在许多情况下不必检测某一性状的遗传，因此加快了育种的进程。
第一个标记被用来研究双孢蘑菇的性别。它们是表型特征如结菇能力（可育与不育）、营养缺陷、孢子梗颜色及“野生”形态(Miller & Kananen,1972; Raper et al.,1972;Miller et al., 1974; Elliott,1972)。杂交种中这些表型的表达及在单孢子代中的遗传的研究无疑奠定了双孢蘑菇性别区分的基础，因此揭示了其育种的潜力。然而这些标记只能在子实体中检测。随着基因产物（蛋白）或DNA序列本身作为遗传标记的引入，一个实用且非常强大的技术在育种中变得可行。这些标记的优点是：（1）数目巨大；（2）表达和检测与生活史分开，从而在无性菌丝中可以检测；（3）共显性，即在杂交中可以检测双个等位基因。Royse 和 May（1982）首次引入了这些标记之一，即同工酶。同工酶是具有相同反应特性而氨基酸组成稍有不同的一类蛋白。这些差异导致电泳迁移的不同，因此在聚丙稀酰胺凝胶上产生不同的带型。Royse 和May证明了同工酶在菌株分型和选择性育种中的用途(Royse & May,1982a,1982b)。作为DNA标记的第一个技术是限制性片段长度多态性(RFLP, Botstein et al., 1980)。该技术使用限制性内切酶，每种酶识别双链DNA上的单一位点，并在这些位点上断开双链。产生的片段可按长度在凝胶上分开并转移到尼龙膜，然后用标记探针进行杂交，这些探针是一些短的DNA片段，可与尼龙膜上的互补序列结合。独特带型显示的限制性片段数目和大小的不同反映了DNA序列的差异。由于有许多不同的限制性酶和甚至更多的可能的探针，该技术产生的标记的数量接近无限。Horgen和Anderson小组第一次在伞菌研究中引入该技术(Anderson et al., 1984; Castle et al.,1987;1988; Summerbell et al., 1989)。该技术用于分离同核体时，看来是个强大而可靠的工具(Kerrigan et al.,1992)，并被用来构建双孢蘑菇的遗传图谱(Derrigan et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996a)。除了RFLP，人们还发明了一个甚至更有效的方法来检测DNA序列的差异，即多聚酶链式反应(PCR, Mullis et al.,1986)。PCR是合成和扩增DNA的一种体外方法，待扩增的序列被短单链DNA序列限制在特定区域。该项技术非常灵敏而且迅速，原则上只需几个DNA分子，通过循环反应，在数小时内可扩增出相当的数量，通过染色可在凝胶上直接看到条带。标准PCR的前提条件是要知道待扩增片段的序列。等位基因间的差异如插入和缺失将产生不同长度的PCR片段。碱基替换造成等位基因位点的特异性，据此可设计出等位基因特异引物。这种PCR即通常所说的SCAR（确定序列扩增区域，Paran & Michelmore,1993）。即使不知道某一生物体的任何序列，PCR也可以用来产生遗传标记，即使用很短（10bp）的引物可进行随机扩增(随机扩增的多态性DNA；Williams et al.,1991)。Khush等人（1992）表明这些类型的标记可用于双孢蘑菇菌株分型及分离分析。
5 标记中的一个特殊种类――重复序列
遗传分析中功能最强的标记来自于重复序列。它们可以很短，也可以是整个基因；每个单倍体基因组中可以有几个拷贝，也可以有成百上千个拷贝。使用重复序列作标记的优点是单个探针可以监控许多位点，因此在菌株作图和指纹分析中它是一个强有力的工具。
所知的一类重复序列是微卫星或称简单序列重复（SSR）。微卫星是衔接排列的1-5个核苷酸重复单元，单元的数目从2到数千不等。它们分布于包括真菌在内的所有真核基因组中(Tautz & Renz,1984)。微卫星中重复单元的数目是高度可变的，取决于复制滑动、不平等互换或其它未知的机制(Levinson & Gutman,1987; Schlotterer & Tautz,1992; Strand et al., 1994)。微卫星主要用于PCR反应，可根据微卫星序列使用引物，如果微卫星的不同拷贝较为靠近，其间的DNA就可以被扩增出来。另外也可以使用微卫星两侧的引物，因为微卫星的长度是可变的，当不同菌株的DNA作为目标时，微卫星两侧的引物可产生大小不同的条带。一个好的例子是最近发表的鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)图谱，标示了120个所谓的序列标志微卫星位点（STMS）(Winter et al.,1999)。微卫星已用于双孢蘑菇基因组的研究（与M.Loftus和 J.Labarere的个人通信），但尚未发表任何使用情况的数据。
微卫星的长度变化最近由于完全不同的原因已成为一个热门的研究课题。人类数目渐增的遗传失调与转录或非转录序列三核苷酸重复单元的反常扩增有关(Dijan,1998)。其在真菌中是否有类似的作用不得而知，但最近有报道在Podospora anserina中微卫星长度与一个报告基因的表达存在连锁关系(Khahnobish et al.,1999)。
5.1 可移动的遗传因子
真核基因组中研究最透彻的重复序列中有些是转座因子或称转座子。它们是可移动的遗传因子，靠与非同源区域的结合可以漫延到整个基因组。在真核基因组它们可以极高的拷贝数存在，在果蝇基因组中占到10%，而在某些植物基因组中超过50%(Freeling,1984)。最近在丝状真菌中也发现了转座子(Oliver,1992)。真核转座子可根据它们的转座方式细分为两类。I类转座子通过RNA介导转座并通常编码许多基因，其中总有一个是反转录酶基因(Boeke & Corces,1989)。II类转座子转座时需要单个蛋白，比如转座酶，它在供体和目标DNA剪接过程的处理中起作用(Plasterk,1995)。尽管以非复制方式转座，II 类转座子也可以靠从已复制的DNA转座到尚未复制的DNA或同源姐妹染色单体间的互换来增加数量(Plasterk, 1995)。两种类型的转座子已在真菌中发现（请看近期回顾：Daboussi & Capy,1997; Kempken & Kuck, 1998）。
近来在双孢蘑菇中已发现其它真菌中描述过的转座子的大多数类型。实际上，双孢蘑菇是被描述过这些可移动因子的第一个担子菌(Daboussi & Capy, 1997; Sonnenberg et al., 1999)。
II类转座子中的一个成员Abr1是双孢蘑菇中所描述的第一个可转座因子(Sonnenberg, 1999)，它是一个300bp的短重复序列，两侧由11bp的反向重复序列包围。商品菌株中每个单倍体基因组约有15个拷贝。短序列和实质编码区长度的缺乏表明Abr1本身并不编码转座酶，其活动性依赖于定位在另一条染色体上具转座活性的一种转座酶，但没有发现有关这种转座酶的任何证据。子代分析显示Abr1拷贝有一个正常的分离，表明没有发生有效的转座。这使得该重复序列在育种和后面即将谈论的菌株间的关系研究上成为非常有用的标记。
我们最近还发现双孢蘑菇基因组中I类回复转座子的两个成员。多数这种类型回复转座子的典型特征是存在长末端重复序列（LTR）和两个开放读框（ORF）。第一个ORF编码的一个基因与逆转录病毒中编码病毒粒子外壳的gag基因具有同源性。
第二个ORF与逆转录病毒的pol基因具有同源性。该开放读框产生病毒基因组复制及移入宿主基因组所需的多种蛋白。这些I类回复转座子本身也可根据序列相似性及开放读框上的基因序列细分为两组。第一组命名为Tyl/copia，第二组Ty3/gypsy，都是在这二组的第一个转座子发现之后命名的。
图2 双孢蘑菇中发现的第一个回复转座子的示意图。图中多蛋白基因似有缺失，加上严重的甲基化作用，表明该转座子不是活动的。
双孢蘑菇发现的第一个回复转座子命名为Tab1（Transposon of A.bisporus），属于Tyl/copia组。它与植物中首次发现的回复转座子之一烟草Tnt转座子有很高的相似性(Grandbastien et al.,1989)。其LTR的长度为260bp，两个开放读框（图2）被鉴定为编码前面提到的gag 和pol基因。商品菌株中发现了Tab1的一个近乎完整的拷贝（4037bp），命名为Tab1-1。Tab1-1与同组其它的LTR回复转座子的联合比较表明编码反转录酶的pol基因区域中有近600bp的缺失。用Tab1-1作探针在商品菌株中可见到多条带，表明Tab1以多于一个拷贝的形式存在。我们分析了两个包含Tab1序列的其它基因组克隆，两个克隆中均发现被截短的代表部分pol基因的Tab1拷贝。这些Tab1拷贝的切断看来是由于其它可转座因子的插入。数据库检索揭示第二因子与来自口蘑属Tricholoma nauseosum的一个未发表的可转座因子及稻枯病真菌Magnaporte grisea基因组中发现的回复转座子MAGGY高度相似(Farman et al., 1996)。双孢蘑菇中发现的序列命名为Tab2，是依照它与Ty3/gypsy回复转座子的一个成员MAGGY的相似性。在两个基因组克隆分析中，Tab1被Tab2 3’端的插入打断，该3’端包含部分pol基因（整合酶）和一个842bp的LTR。当Tab2 序列被用作探针时，在包含商品菌株DNA的Southern印迹中可见到大量的条带，表明该转座子以高拷贝数存在。对其它几个包含Tab2 序列基因组克隆的分析再次揭示只有Tab2 3’末端或LTR序列的存在。在白色双孢蘑菇中Tab2 是否存在一个全长的拷贝目前尚未得知。
以上所述表明双孢蘑菇基因组包含多数真核基因组中发现的LTR回复转座子的两种类型，且至少所分析的拷贝是不完整的。在描述过这些因子的首批担子菌中，双孢蘑菇是其中之一。序列联合比较显示Tab1的不同拷贝间存在高同源性（>96%），多数序列差异（85%）是由于GC向AT的转换。这表明在双孢蘑菇中一个突变机制可能已激活，该机制类似于粗糙脉孢菌中首次描述的RIP（重复诱导的点突变）（Selker,1990）。RIP是探测并通过多个GC向AT的转换有效改变基因组复制的一个机制。重复单元不同拷贝间因而发生的序列转换阻止了可能存在的危险的异常重组并同时灭活转座子。不同Tab2拷贝相关区域间的序列联合比较揭示了序列的高度保守性，但基于转座的序列转换更少报道。基因组中重复序列可被改变的另一个已知的机制是Ascobolus immersus中所描述的MIP（减数分裂前的甲基化诱导）(Goyon & Faugerton,1989)。该机制与已复制序列严重的胞嘧啶甲基化有关，是灭活转座子的另一个途径。检测序列是否被甲基化的一个有效方法是利用对甲基化敏感性不同的一对限制性内切酶。比如限制酶HpaII和MspI，均识别序列CCGG，而当第二个胞嘧啶被甲基化时，HpaII不再消化该位点而MspI却对甲基化不敏感。用Tab1-1作探针，通过Southern印迹检测经HpaII和MspI消化过的商品菌株DNA，可发现甲基化的清晰证据。从带型上可看出很大的不同，经HpaII消化的基因组DNA得到大分子量的带而用MspI时得到的带分子量较小。用Tab2作探针时得到相同的结果。类似RIP的突变及严重的甲基化均表明两种类型的转座子在已检测的商品菌株基因组中都是不活动的。然而，当检测来自同一菌株的不同批菌丝体时，发现Tab1的甲基化图谱是高度可变的，这一点令人感兴趣。甚至在同一菇床上随机分布的不同子实体间也可见到带型的差异。是什么引起可变的甲基化作用，是否对表型有影响还不得而知。
应用根据Tab1的LTR区域设计的引物在一个野生菌株同核体中扩增出一个4660bp的片段，部分序列分析显示该拷贝在pol基因中没有缺失发生。由于该拷贝比商品菌株中发现的Tab1-1拷贝长，所以该回复转座子可能是完整无缺的。Southern分析表明这个野生菌株的同核体中Tab1只有单个拷贝。当用限制酶HpaII和MspI进行消化时，发现带型没有差异，表明野生菌株中的单拷贝没有被甲基化。这与其它报道中只有重复序列被甲基化的情况相符(Faugerton et al.,1990)。目前我们正在测试命名为Tab1-4的该Tab1拷贝是否可被转录，如果可以，则可能仍有活性。
最后的一个重复序列作为一个EcoRI消化的片段从蘑菇的基因组中被幸运地克隆出来(Castle et al., 1987)。使用该片段作探针在双孢蘑菇、大肥菇、A.subfloccosus和A.pattersonae中可见到中度重复序列(与Kerrigan的个人通信)。目前尚未确定该重复序列的明确界限，并且在数据库中没有发现与任何序列具有同源性。最新的重复序列被命名为Abr3。
6 系统发育和重复序列；现代杂交种的起源
重复DNA和可转座因子的迁移性被认为是基因组可塑性的一个重要机制和物种变异性的一个来源(Dobinson & Hamer,1993; Daboussii & Capy,1997)。因此，以上提到的重复因子在更好地研究菌株起源和它们的相互关系上显得非常有用就不足为怪了。用Abr1、Tab1和Abr3作探针，在8个传统栽培菌株中只见到两种不同的基因型（图3）。这两种基因型与1980年以前使用的传统栽培种的表型（白色与乳白色）相一致(Fritsche & Sonnenberg,1988)。这意味着用不同名称进入市场的许多菌株在遗传上非常相似。当用同样的探针检测现在的杂交种时获得了可比的结果。在测试的9个商品菌株中只发现一种基因型（图4）。大多数商业杂交种的来源是保持完好的秘密。而Horst U1的构建已被很好地证明(Fritsche,1983)。Horst U1是由白色菌株Somycel 53的培养物H39与乳白色菌株Somycel 9.2的培养物H97分离出的不育单孢杂交后获得的。该杂交种上市后几个月内便出现了其它杂交种。在表型上与第一个杂交种并不能区分的这些“新”杂交种的上市时间暗示了它们要么是第一个杂种的复制品，要么是其可育单孢分离物。在后一种情况中，表型保持不变并不足为怪，因为双孢蘑菇典型的生活史趋向于在子代中保留亲本的杂合性(Summerbell et al.,1989)。前期研究表明在白色和乳白色菌株中Abr1的多数拷贝在基因组中的定位是不同的(Sonnenberg et al.,1999)。Tab1基因组定位的检测获得了相似的结果（未发表）。这些差异最具争论的解释是转座子已自主分布到每个菌株。换句话说，如果两个菌株有一个共同的祖先，则两种类型栽培种分离后已发生了转座。由于近期没有迹象表明两个转座子发生了转座，这些结果暗示了两种类型的栽培种并不紧密相关。当用Abr1、Tab1和Abr3作探针时，当今的棕色菌株也显示了一致的带型。然而这些带型与白色或乳白色菌株中所见的带型差异很大（图3）这意味着传统栽培种至少可细分为在遗传上不相关的三种类型。因此，原先认为世界上所有的双孢蘑菇传统白色栽培种均来自1926年发生于奶油色蘑菇菇床上的那丛著名的“雪白”蘑菇(Lambert,1959; San Antonio,1984)的看法并不确切。
图3 用重复因子作探针的传统栽培种的指纹图谱。A片：Abr3作探针的带型。Lane 1:Le Lion B62; 2:Sinden A4; 3:Somycel 9.2; 4:Le Lion B14; 5:Les Miz 66; 6:Les Miz Y217; 7:Somycel 53; 8:Amycel 2400; 9:Amycel 456; 10:Le Lion C9; 11:Royal 101; 12:Marker。B片：Abr1作探针的带型。 Lane 1:Le Lion B62; 2:Sinde A4; 3:Somycel 9.2; 4:Somycel 76; 5:Le Lion B14; 6:Les Miz 66; 7:Les Miz Y217; 8:Somycel 53; 9:Amycel 2400; 10:Amycel 456; 11:Le Lion C9; 12:Royal 101; 13:marker。三种类型栽培种表示为I：乳白色菌株，II：白色菌株，III：棕色菌株。
重复序列在野外收集菌株的基因分型中也非常有用。栽培种中见到的一致性和蘑菇属种质工程(Kerrigan,1996)菌株中见到的高度可变性形成了对比。然而，当用Abr1和Tab1对野外收集物进行筛选时也发现了一些惊人的相似性。采集自邻近地点的许多菌株显示出相同或相似的图谱表明了这些菌株间的无性繁殖关系。也发现有的图谱与三种传统栽培种之一相同，这可能代表“逃脱”的菌株或已被驯化的原始野生菌株。双孢和四孢品种中Abr1拷贝数目的显著差异也支持Abr1在系统发育研究中的有用性(Sonnenberg et al.,1999)。
用转座因子作探针筛选ARP收集物时，偶然见到有的菌株根本没有杂交信号。从ARP收集菌株得到的有效数据表明这些菌株可能代表不同于双孢蘑菇的另一个种。因此我们检测了好几个蘑菇种和其它一些代表性食用菌的种中是否存在这四个重复因子（表1）。这些分析显示所有因子在非蘑菇种中均不存在，且Abr1和Tab2只存在于双孢蘑菇中。因此，从野外收集菌株中鉴定出双孢蘑菇种质，这些重复因子是非常有用的。
图4 用3个不同重复因子作探针的9个商品菌株的带型。Lane 1:Amycel 2800; 2:Le Lion X8; 3:Somycel 608; 4:Horst U1; 5:Int.Spawn 643; 6:Sylvan 100; 7:marker; 8:Le Lion X22; 9:Le Lion X20; 10:Somycel 512。每个分析使用的探针标示在下方。
表1 重复因子在不同食用菌种中的出现
物种 Abr1 Abr3 Tab1* Tab2
大肥菇 － ＋ ± －
野蘑菇 － ＋ － －
赭鳞蘑菇 － ＋ － －
球基蘑菇 － ＋ ＋ －
蘑菇 － ＋ ＋ －
Agaricus excellens － ＋ ± －
巨孢蘑菇 － ＋ ＋ －
杨树菇 － － － －
侧耳 － － － －
Stropharia rugoso annulata － － － －
毛头鬼伞 － － － －
紫丁香蘑 － － － －
双孢蘑菇（白色） ＋ ＋ ＋ ＋
双孢蘑菇（乳白色） ＋ ＋ ＋ ＋
双孢蘑菇（棕色） ＋ ＋ ＋ ＋
*± 弱杂交信号
7 数值标记和连锁分析
标记可以通过它们的亲本类型在子代中的遗传而确定其在基因组的位置。一般来说，当标记被定位于同一条染色体上时，亲本类型在超过50%的子代中被共同遗传。当定位于不同的染色体上时，发现亲本与非亲本类型的比例为1:1。对分离数据的解释或曲解的难度可以有许多理由。其一是亲本类型的不均衡分离可能是由于子代中不存在某种遗传组合。另外，当一对标记位于染色体相对的末端，重组频率将可能接近于50%，与位于不同染色体上的一对标记类似。这些及其它模糊问题可以通过在完整分离的染色体上设定引物而得以解决。多数真菌染色体大小范围在1-10Mb之间并可以通过脉冲场凝胶电泳完整地分开(Chu et al.,1986)。好几个研究小组已解决了双孢蘑菇的染色体问题(Royer et al.,1992; Lodder et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)。Sonnenberg 等人（1996）已将组成Horst U1的两个同核体分离为11条带。多个DNA序列（探针）与包含完整染色体的膜杂交而应用于染色体研究。这些数据结合分离分析明确表明每个同核体的11条带代表13条染色体。
由于连锁分析是高效育种工程的基础，遗传标记的数值表示应该是快速而可靠的。同工酶标记和RFLP是非常强大的标记，在没有图谱数据可用时，它们实际上成了选择标记(Spear et al.,1983; Kerrigan et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)。然而这些类型标记的检测是耗时的。当用重复序列作探针时，可即时监测许多位点的分离，双孢蘑菇中已用到Abr1、Tab1和Abr3（将有进一步的说明）。以PCR为基础的标记分析更是快速得多，特别是不需要任何序列数据的RAPD分析。而基于已知序列的PCR分析如前面提到的SCARS，则更为可靠。
图5 以两个不同的重复序列为引物组合获得的PCR片段的带型。用“P”标出的泳道代表亲本类型，用“offspring”标出的泳道显示条带的分离。凝胶右边的数字表示染色体，通过分离分析各个条带可指定到相应的染色体上。
图6 通过重复序列标记（RFLP或PCR）的分离分析构建的一个遗传连锁图。以每条染色体上末端为起点的标记位置标在左侧，标记名称标在右侧。
类似于由长度变化和微卫星基因组位置引起的基因组变异的检测（见第5节），前面论述的双孢蘑菇中类转座子序列可用于相同的途径。人们发展了一种基于PCR的方法检测包含一个Abr1拷贝的位点。结果显示了在两个传统栽培种中，该遗传因子在基因组上的定位是不同的。一个栽培种类型的Abr1两侧的一对引物在另一栽培种类型中产生较短的片段，原因是后者中Abr1的缺失。设计了包含转座子Tab1区域的类似引物。另外，还设计了转座子序列引物并用不同组合扩增相邻转座子之间的基因组区域。这看来已成为位点作图的最有效的方法之一。图5显示用一个引物对（每个代表不同的重复序列）扩增一个栽培菌株和一个野生菌株的同核体及它们的同核子代的带型。用该特异引物对，可立即标出6条染色体上的6个位点。结果清楚地体现了重复序列中作图中的价值，图6给出的遗传图证明了这一点（DRAWMAP软件建图，Stam,1993）。不管使用的是RFLP技术或PCR，该连锁图上的标记几乎全部来自重复序列。不同染色体上标记密度的变化反应了重复序列在双孢蘑菇基因组内的分布。不同重复序列与分离的完整染色体杂交结果显示，特别是11号和12号染色体包括了Tab1和Abr3的许多拷贝，而9号染色体不包含任何已知的转座子类似序列。该条染色体仅包含一个重复序列，体现于包含核糖体DNA基因的衔接排列的核糖体单元。因此，图中所示9号染色体上的标记可能代表一个特殊的PCR片段。
该图还显示了两个与PCR标记连锁的重要表型，即位于1号染色体上的交配型和8号染色体上的菇盖颜色。由于该图中所用的子代来自一个商品菌株与野生菌株的杂交种，这些结果也表明了野生同核体有13条染色体。到目前为止我们研究过的其它野生同核体具有相同的染色体数目，包括四孢变种A.burnettii。这暗示着在双孢蘑菇种内13条的染色体数目是一个标准。
8 与表型连锁的标记
遗传标记可以用来标出由某一位点决定的、通常以“是/否”方式表达的性状，也可标出通常由更多基因决定的更为复杂的数量表达性状(Lynch & Walsh,1998)。目前双孢蘑菇中仅有有限数量的表型与遗传标记连锁，所有这些表型看起来主要由单一位点决定。最初的一个是交配型(Xu et al.,1993; Sonnenberg et al.,1996)，它被定位在最大的染色体即1号染色体上。双孢与四孢蘑菇杂交种子代的分离分析表明同一条染色体也包含了担孢子数目（BSN）的主要决定因子(Imbernon et al., 1996)。两个表型在育种工程中均扮演着突出的角色。与交配型连锁的标记在双孢蘑菇对双孢蘑菇次级同宗配合的同核体筛选中特别有用。包括交配型在内的所有位点在同核体中主要是以同点等位基因存在的。然而异核体子代由于重组产生的多个位点也可以是同点等位基因。一般来说，筛选生长缓慢的单孢分离物（SSI）可得到高比率的同核体(Fritsche,1984)。而在单孢分离物中预筛选生长缓慢者，再用交配型连锁的标记进一步筛选同点等位基因，则获得的几乎所有的单孢分离物均是同核的(Kerrigan et al.,1992; Sonnenberg, 未发表)。同样的标记在选择用于回交或与其它菌株交配的合适的交配型等位基因方面也是有用的。与担孢子数目连锁的标记可用于向商品菌株引入远系的性状。四孢担子的出现将加快同核单孢分离物的分离。发现的另一个重要表型的遗传标记是菇盖颜色或称pilei-pellis颜色(Loftus et al.,1995及本论文集,Callac et al.,1998; Sonnenberg,本文)。
要发现其它重要性状如产量、质量及抗病性的标记将更加困难。这些性状通常是数量遗传并且象是由多基因决定。另外，由于同时产生的遗传和环境的影响，对这些性状的评估是困难的。在双孢蘑菇野生菌株中已发现对细菌性斑点病(Olivier et al.,1997)和干泡病(Dragt et al.,1995)的抗性或低敏感性。在评估托拉斯假单胞杆菌(Olivier et al.,1997)和真菌寄生轮枝菌(Mamoun & Olivier, 1995)的感染方面已取得一些进展，但仍缺乏满意的数量表示方法。可重复的量化方法是发现与这些性状连锁的遗传标记的前提。
在一批来自栽培种与野生种的杂交菌株的子代中，我们测量了第一个菇蕾形成的时间以及两个菇潮的平均菇柄长度。应用MapQTLTM软件(Van Ooijen & Malienaard,1996)发现了与这些性状（LOD3.0）显著连锁的染色体区域，表明原则上可以发现数量性状的标记。
继核DNA编码的性状作图之后，重点要指向作为基因组变异的一个来源的线粒体基因组。De la Bastide等人（1997）为线粒体DNA序列和核-线粒体相互作用对双孢蘑菇生长的影响提供了证据。把线粒体基因组包括到育种工程中应该不难，因为双孢蘑菇野生种群的线粒体DNA中存在广泛的变异(Xu et al.,1998)，并且杂交和去异核化会产生许多核-线粒体组合体(Khush et al.,1995; Sonnenberg et al.,1995)。
9 遗传转化
继经典育种之后，选择性标记的改进，使得一项新技术在育种中已变得实用，即遗传转化。该技术通过引入其它菌株或其它物种的DNA序列、基因组整合并表达使菌株的遗传改变。该技术已在植物、动物和真菌的育种中完全实现，但直到现在，该技术在双孢蘑菇中仍不实用。关于双孢蘑菇遗传转化的第一个报告可追溯到1996年(Van de Rhee et al.,1996)。在这儿潮霉素抗性被引入作为转化细胞的选择标记。结合在一个广泛使用的质粒上的标记用标准技术导入原生质体。然而其它实验室到目前为止仍无法重复该转化系统(Van de Lende & Wessels, Challen, Mikosch,个人通信)。最近，原先为植物细胞转化设计的农杆菌转化系统被应用到双孢蘑菇和许多其它真菌的转化中(De Groot et al.,1998)。该系统在其它实验室看来也可转化。Mikosch等人（本论文集）已能进一步优化该技术，使之成为转化双孢蘑菇无性菌丝体的有效方法，从而使商品菌株的遗传改变具有可能性。
遗传工程食品在消费者中暂时并不流行。但系统本身是基因功能研究的一个不可缺少的工具。它允许序列在基因组中有目的的整合，也因此可造成被选择基因的中断。对已知表型的继后研究可阐明各自基因的功能。该基因工程工具也为工业或医药用途的非食品成份的生产菌株的构建提供了前景。额外的作用是能扩大食用菌产品市场，因为消费者对遗传改变在非食品目的上的应用一般反应较为平淡。
10 总结性评论
以上提供的信息表明双孢蘑菇新菌株开发的前提条件均已得到满足。生活史已知且允许育种。多样化的野生收集菌株是有用的，其中已发现许多令人感兴趣的特性。最后，育种新技术的开发已取得重要进展，特别是遗传标记的发展与检测。食用菌业中的许多人常常提出这样的问题：新菌株何时问世？为什么要花这么长时间？我希望本篇综述已讲清楚这一点，即直到最近，产生新菌株的所有前提条件才得到满足。Fritsche推出第一个杂交种时迈出的重要一步是不容易重复的。她用传统栽培种制造新菌株(Fritsche,1986)，这些栽培种得到了许多在育种过程中被明显保留下来的优良性状。然而，许多有意义的性状栽培种中不存在，却在毫无商业价值的野外收集菌株中发现。虽然标记技术显著加快育种的进程，但要把一个特殊性状转移到当今商品栽培种中也是一项耗时的工作。一般观点认为我们现在离新菌株的诞生为期不远了。作这种声明需要一定的慎重，因为经验表明,“不久将出现”的承诺与市场上实际出现之间可能还有一段时间(Loftus et al.,1995)。
11 致谢
本工作由Bromyc和海牙园艺产品局提供部分支持。我想特别感谢Jose in ‘t Zandt-Linders和Karen den Hollander女士的技术帮助及L.J.L.D.van Griensven和J.J.P.Baars的有帮助的评论性意见。
参考文献（略）
