双孢蘑菇杂交新菌株As2796选育
福建省轻工业研究所, 福州, 350005
摘要：应用酯酶同工酶为遗传标记，在高产菌株(H型)与优质菌株(G型)的同核不育株间做了380个组合的配对杂交, 选出杂交种子一代(F1)W95-2等, 再经单孢分离出2000多株单孢培养物, 从中筛选获得高产优质的杂交种子二代(F2)菌株As2796。该菌株酯酶同工酶PAGE表型为HG4型,呈典型的杂合态。菌丝培养特性与栽培特点与高产亲本02相似, 在24℃仍能结菇, 平均单产比优质亲本菌株8213(G型)提高50%-100%。鲜菇与罐藏质量表现与优质亲本8213相似, 经检验符合部颁标准。经89-92年三个产季的初筛、复筛和中型生产试验，表现稳定，已向全国推广。
关键词：双孢蘑菇 杂交菌株 高产 优质 耐热
１ 前言
杂交技术在双孢蘑菇选育种中的应用，迅速促进了品种的改良。自从荷兰蘑菇育种家Fritsche于1981年育成商品化杂交菌株U1与U3(Fritsche,1983), 并在欧美广为栽培以来,新的杂交菌株在世界各地不断推出, 目前已占蘑菇生产用种的65-90%。我国是双孢蘑菇生产大国, 进行蘑菇杂交育种的必要性已被阐明(王泽生, 1992)。福建省轻工业研究所从1983年开始研究双孢蘑菇杂交育种, 至今已选育出As376,As1671和As1789等遗传上偏G型的杂交新菌株在生产中推广应用， 仅在福建省的推广面积累计即达2000多万平方米, 比老品种8213等增产20%左右,在保持了优良的鲜菇与制罐质量的前提下,为菇农新增5000多万元的经济效益。1992-2000, 福建省轻工所又推出遗传上呈HG4的杂交新菌株As2796, 推广面积超过3亿平方米, 累计增产鲜蘑菇60万吨, 增加菇农收入20多亿元。本文报导该菌株的选育过程及其菌株特性。
２ 材料与方法
2.1 菌株
供试14株双孢蘑菇的异核体菌株02(H2型高产品种, 引自荷兰), 8213(G1型优质品种, 老法国种, 福建保留)等, 它们的同核体菌株361-2(Hs1), 165(Gs2)等28株(王泽生等, 1990)均由福建省蘑菇菌株研究推广站提供。
2.2 配对杂交技术
亲本菌株及配对组合的选择方法，同核单孢的分离培养、鉴定与配对杂交技术, 杂交种子一代(F1)与子二代(F2)的分离、鉴定步骤均同前法(王泽生,廖剑华,1990;王泽生,王贤樵,1990; 王泽生,1991)。
2.3 筛选
2.3.1 实验室筛选
1. 耐温培养：同一菌株接种于含水65%的常规粪草管中, 分别在16, 20, 24, 28和32℃下培养， 每种3重复, 观察菌株在低温与高温下的走菌速率。
2. 耐水培养: 同一菌株分别接种于含水55, 65, 70和75%的粪草管中, 在24℃下培养， 每种3重复, 观察菌株在偏干(55%)与偏湿(75%)情况下的走菌速率。
2.3.2 栽培筛选
1. 初筛: 所获F1代杂交种均以床架式花盆或浅箱栽培。每个花盆或浅箱投粪草干料0.5Kg或4.5Kg, 面积为0.028M2或0.15M2。每株均做3重复, 在床架上按随机区组排列。所获得F2代杂交种初筛同F1代。
2. 复筛: 做床架式栽培, 每区面积1M2, 投粪草干料30Kg, 每菌株4重复。
3. 中型生产试验: 每个菌株试验面积不小于2000M2, 在全省东、南、中三区分别设点。
上述栽培培养料的配方、二次发酵堆制技术与栽培管理技术均按福建省轻工业研究所提出的福建省地方蘑菇标准（推荐）(王振川等, 1990)。在初筛与复筛中，观察菌株的菌丝生长速率，栽培特性和产质量性状。描述方法同前（王贤樵,王泽生,1989; 王泽生, 王贤樵, 1990）。中型生产试验除了做上述观察外还需按部颁标准取样制罐,并开罐检验罐藏质量。
2.4 同工酶检测
酯酶同工酶电泳样品制备, 聚丙烯酰胺凝胶制备、电泳及结果分析方法均同前（王贤樵, 王泽生, 1989）。
３ 结果与分析
3.1 选育过程
以酯酶同工酶为遗传标记，从供试异核体亲本中共分离出2578个单孢培养物,获得158个具有S型酶谱的推定同核体,选出Gs型培养物16个, Hs型培养物12个, HGs型培养物8个, 共作380个配对杂交组合。从获得的F1代杂交种中选出HG4和HG5型菌种,并从中分离出2000多个单孢培养物参加同工酶鉴定分型后,有400个培养物进入实验室筛选。优选后有200个新菌株进入栽培初筛,40个进入复筛, 10个进入中试, 其中之一是As2796。它是高产型亲株02和优质型亲株8213的同核不育株配对杂交种W95-2(F1)的单孢分离培养物(F2)(图1)。
MSI*, IE*
02 361-2(Hs1) MSI, IE
MSI, IE W95-2(HG4) As2796(HG4)
8213 As165(Gs2)
图1 杂交新菌株As2796的选育途径
Fig1 The breeding Program of the hybrid strain As2796
*MSI: Monospore isolation, 单孢分离; IE: Isozyme examination, 同工酶检测
3.2 生物学特性
3.2.1 在PDA培养基上菌丝呈银白色, 基内和气生菌丝均很发达, 生长速度中等偏快, 在麦粒或粪草培养基上菌丝生长快且强壮有力,一般不结菌被。
3.2.2 在含水量为55, 65, 70或75%的粪草料中, 菌丝生长速率相近, 最适65-70%。在16-32℃下菌丝均能生长, 最适24-28℃(表1)。结菇温度10-24℃, 最适14-20℃。表现出较强的适应性, 尤其是耐热能力, 保持了02的特点, 即使在32℃下培养， 菌丝也不死亡而且仍能生长。
3.2.3 酯酶同工酶遗传型为HG4型, 呈典型的杂合态(图2), 1989-2000年间所测无性繁殖(转管)培养物的PAGE表型稳定。
表１ 不同试验条件下各菌株在堆肥培养基上的菌丝生长速率（mm/day）
Table1 Mycelial growth rate (mm/day) of different strains on compost medium under
different experimental conditions
菌 株
处 理
湿度: 65 65 65 65 55 65 70 75%
温度: 16 24 28 82 24 24 24 24℃
As1671
As1789
8213
As2796
02
ZN1
2.0 3.3 3.7 0 3.3 3.3 3.4 2.9
1.6 4.0 2.6 0 3.2 4.0 3.9 3.7
2.2 3.9 2.8 0 3.5 3.9 3.2 3.1
1.6 3.7 3.3 1.5 3.1 3.7 3.6 3.5
2.2 3.7 3.2 1.1 3.2 3.7 3.8 3.5
1.9 3.4 3.2 0 3.3 3.4 3.8 3.3
* 表中数据均为三重复的平均数
图2 杂交菌株As2796及其异核与同核亲本(菌丝)样品的酯酶PAGE表型
Fig2 The PAGE patterns of EST from the mycelium of the hybrid strain As2796 and its homo or heterokaryotic parents. G1:8211, Gs2:As165, HG4: As2796, Hs1: 361-2, H2: 02
3.3 栽培特性
As2796适用于经二次发酵的粪草料栽培, 表现出耐肥, 耐水和耐高温的特点, 要求每平方米投料量30-35Kg, C:N≈28-30:1, 含氮量1.4-1.6%, 含水量65-68%, pH值在7左右, 正常管理的喷水量不少于高产菌株。菌种播种后萌发力强，菌丝吃料速度中等偏快，生长强壮有力，抗逆性较强，尤为耐高温。菌丝爬土速度中等偏快，纽结能力强，纽结发育成菇蕾或膨大为合格菇的时间较长，因此开采时间比一般菌株迟3天左右。该菌株基本单生，成菇率高(90%以上), 成品率高(80%以上), 1-4潮产量分布较均匀(图3), 转潮不太明显, 后劲强, 有利加工厂生产。气温超过20℃,甚至达到24℃时一般还不会死菇, 可比一般菌株提前15天左右栽培。不宜薄料栽培, 料含氮量太低或水分不足都会影响产量或产生莆菇和空腹菇等质量不良现象。
图3 不同遗传型菌株床栽产量结构比较(90-91产季栽培;每平方米面积收菇量)
Fig.3 The fruiting modes of the strains with different genetic types cultivated n shelf system during 1990-1991 growing season
■ As2796 □× ZN1 □ 8213
3.4 鲜菇与制罐质量
鲜菇子实体呈中等大小, 直径一般为3.0-3.5cm。外形圆整, 色泽洁白, 无鳞片, 有半膜状菌环。菌盖厚, 柄中粗、直短，组织结实，菌褶紧密、细小、色淡，无脱柄现象(图4)。每公斤含菇90-110粒(表2)。通风口或阳光照射, 菌盖表面呈浅棕色, 漂洗后仍呈白色。制罐平均预煮得率65%, 吨耗900Kg, 整菇率50%, 开罐后色泽正常，汤汁清晰, 组织结实, 风味好, 未见发灰黑现象(表3)。质量明显优于高产菌株(H型)而与优质菌株(G型)(王贤樵等,1989)相似, 符合部颁标准。
表2 As2796在不同试验阶段平均单菇重(g)
Table 2 The average weight (g) of one mushroom of As2796 in different fruiting trials
产 季 8211 8213 As2796 02 ZN1
1989-1990 (花盆初筛) 6.3* 6.5 6.0 5.9 4.6
1990-1991 (浅箱初筛) 9.0 8.3 10.0 5.8 6.3
1990-1991 (床架复筛) 10.3 12.1 8.0
1991-1992 (床架复筛) 9.6 9.7 11.0 6.0 8.1
* 表中数据均为每产季各抽检15次的平均数。
表3 As2796 罐藏试验情况
Table 3. Data of canning test of mushroom of As2796
取样重量 预煮后 一级品(整菇) 开罐检验
日期 Kg 重量 得率 重量 %
91.11.23 10.65 7.00 65.92 3.634 51.92 色泽正常,组织结实致密,风味好
92.1.4 10.60 6.75 65.56 3.135 47.99 色泽正常,组织结实,风味好
平均 65.74 49.96
* 表中数据由厦门罐头厂提供。
图4 02, As2796和8213鲜菇纵切面图
Fig4 The longitudinal sections of mushrooms of 02, As2796 and 8213
3.5 栽培与产量表现
经过89-92三个产季的初筛、复筛和中型生产试验，结果表明As2796栽培性状稳定, 适应性强, 单产比8213等老品种增加50-100%, 与高产品种相近。大面积栽培平均单产每平方米7.5公斤, 规范化栽培单产每平方米9.0公斤以上, 高产户可达每平方米15.0公斤。
表4数据表明, As2796单产比G型亲本8213提高80%以上, 比偏G型杂交种1671, 1789等增加40-50%, 而和H2型亲本02, H1型杂交种U3的产量相似。
表4 1989-91产季省蘑菇站初筛与复筛栽培试验结果(Kg/M2, 采收时间60天)
Table 4 The cultivation results of the different strains for initial selection in FMRDS
during 1989-1991 growing seasons (yield: Kg/M2 during 60 days)
菌株 1671 8213 As2796 As2768 02 U3
1989-90产季 6.2 4.5 9.3 10.3 8.5 10.4
(花盆) 6.2 5.0 9.3 9.7 9.4 8.4
6.9 5.4 10.2 8.5 9.1 10.0
平均 6.4 5.0 9.6 9.5 9.0 9.6
1990-91产季 8.1 6.1 10.7 11.2 10.1 8.4
(浅箱) 8.1 6.1 11.9 9.9 12.6 10.1
7.3 6.4 11.1 12.7 11.1 10.7
平均 7.8 6.2 11.2 11.3 11.3 9.7
表5数据表明As2796在全省各中试点表现出适应性广, 稳定性强和高产(比其它审定品种增产30-50%)优质(符合制罐标准)的特点。1992年3月经福建省蘑菇菌种审定委员会批准作为试推广用种(第3号公告)，1993年3月批准作为正式推广用种(第4号公告)。
表5 1991-1992产季As2796在全省多点中型生产试验情况*
Table 5 The cultivation results of As2796 in Fujian during 1991-1992 growing season
地区
面积
栽培表现
质量概况
产量概况
厦门：
罐头厂
蘑菇站
10万M2
栽培粗放易管理, 耐高温, 耐肥, 耐水,不易死菇
子实体圆整、结实,每公斤90-100粒,菌褶小、色浅。罐藏符合部颁质量标准
平均单产10Kg/M2, 比8213等高产50-60%
莆田:
罐头厂
蘑菇站
5.2万M2
菌丝生长速度中等偏快,耐肥,耐水, 耐高温,抗逆性较强。无菌被, 结菇能力强,基本单生,成菇率高,后劲足
子实体中等大小,组织紧密,每公斤100粒左右,菌褶色淡,柄粗,短直,无菌环,有菌膜,一级菇18%,二级78%,菜菇4%,罐藏符合部颁质量标准
平均单产9.2 Kg/M2, 最高达15.4 Kg/M2, 比其它省定菌株增产50%左右
福州:
连江
长乐
3.33万M2
3.33万M2
栽培粗放, 耐高温, 不易死菇
子实体盖厚,色白，柄短,菇结实,每公斤100粒左右, 普遍反映质量好
连江平均单产9.2 Kg/M2, 长乐平均单产8.5 Kg/M2
福安:
罐头厂
食用菌办
1.45万M2
栽培粗放, 耐高温, 不死菇
子实体圆整，盖厚,色白，柄短。温度高湿度低时,个别出现”空腹”。罐藏符合部颁质量标准
平均单产8.9 Kg/M2, 比其它菌株高58%
寿宁:
蘑菇办
0.133万M2
菌丝长势粗壮发达, 速度中偏快, 爬土能力中偏强, 对温度适应范围广, 耐肥、水,纽结能力强,成菇率高
菌盖圆整,中等偏大,组织结实,柄中粗短,质量好
平均单产7.5 Kg/M2, 比8213等老品种增产55%
* 表中数据由各中型生产试验产区提供。
表6数据表明As2796在福建的推广应用面积逐年增加，已占全省用种量的90%以上,平均单产稳定在7.5-15.0 Kg/M2。其中规范化栽培单产提高到11 Kg/M2以上，高产户可达18 Kg/M2 (详见附件4-2)。1992-2000年(8个产季)As2796在福建省已推广应用17268万M2, 其它审定品种4312万M2, 总21580万M2, As2796平均占80%，1995-96起均占90%以上。
表6 1992-2000年As2796在福建省栽培情况
Table 6 The results of As2796 cultivated in Fujian during 1992-2000 growing season
产季
菌株
栽培面积(万M2)
占全省用种量 %
平均单产(Kg/M2)
1992-1993
As2796
其它
613
1627
27.5
72.5
7.5-15.0
5.5-7.5
1993-1994
As2796
其它
1505
735
67.2
32.8
7.5-15.0
5.5-8.5
1994-1995
As2796
其它
2000
850
70.2
29.8
7.5-15.0
5.5-9.5
1995-1996
As2796
其它
3000
300
90.9
9.1
7.5-15.0
5.5-9.0
1996-1997
As2796
其它
2400
200
92.2
7.8
7.5-15.0
5.5-9.0
1997-1998
As2796
其它
2500
200
92.6
7.4
7.5-15.0
5.5-8.5
1998-1999
As2796
其它
2600
200
92.9
7.1
7.5-15.0
5.5-9.0
1999-2000
As2796
其它
2650
200
93.0
7.0
7.5-15.0
5.5-9.0
４ 问题与讨论
4.1 As2796的最大特点是耐热, 把双孢蘑菇结菇适宜温度从16℃左右扩展到12-20℃, 使栽培期可前后各增加15天, 延长了收菇期。但当气温低于10℃时, 它的鲜菇质量不如较高温度时好, 因此可以通过控制通风量与喷水量, 尽可能不出菇, 待温度回升时再调水出菇, 确保高产优质。另外要防止菇房昼夜温差太大(>10℃)而引起硬开伞。
4.2 As2796的产量结构均匀, 主要表现在床面上纽结、菇蕾、扣菇和成菇同时存在。边采收，边纽结而且不易死菇。因此要求对床面上的成菇要及时采收。床面菇密时,直径2.5-3.0cm即应采收,一般情况下3.0-3.5cm为宜。留大菇既影响周围小菇生长又影响质量反面达不到高产优质的目的。
4.3 水分管理是As2796高产优质的关键技术。
1.喷结菇重水在菌丝爬土至离覆土层表面0.5-1.0cm时进行,随后加大通风量,控制在此区域纽结成菇,若纽结过于表层,结菇太密易挤成畸形且影响后期产量。若发现纽结过于表层,可再覆一层细土。
2.喷出菇重水,应在喷结菇重水5天后,菇蕾长至黄豆大以上时进行,以水不漏至培养料为准则。每潮菇采收后均应去除根头，补土并停止喷水2-3天,让菌丝恢复生长后再行水管。
3.当菇房湿度偏低,覆土层较干时,均应先调菇房空间湿度,再调覆土含水适宜后,喷出菇重水。否则易造成子实体过干又突然大量吸水，细胞膨大异常迅速而造成空腹。
4.4 As2796具有适应性强,单产高,鲜菇质量优良,制罐整菇率高等优点。它的鲜菇含水量较高，鲜销质量优良，但加工罐头时，预煮得率(65%)介于高产型(62%)与优质型(68%)之间,仍有待于改良,进一步提高罐头加工厂的效益。
4.5在筛选栽培中可观察到As2796与近年从国外引进的杂交菌株U1,R1等(王泽生,1992)相比更适于在我省推广应用，这证明选育适合我国目前生产条件的杂交菌株是必须的也是可行的。
4.6 杂交菌株可用液氮来长期保藏, 但是常规保藏的使用年限一般仅7-8年, 随后可能逐渐发生退化。用组织分离、多孢分离难以复壮杂交菌株(Fritsche,1991), 单孢分离存在着巨大的变异性(王泽生等,1989,1991),筛选技术要求高,工作量较大(王泽生等,1990a,b)。因此要求对遗传上呈典型杂合态的杂交菌株As2796在没有技术条件保证情况下不要进行以生产菌种为目的的孢子分离培养或组织分离培养，以防发生遗传变异或退化而造成经济损失与管理混乱。
参 考 文 献
1. Fritsche,G.1983. Breeding Agaricus bisporus at the Mushroom Experimental Station, Mushroom J. 122:49-53.
2. Fritsche, G.1991. Maintenance, Rejuvenation and improvement of HORST-U1, Genetic and breeding of Agaricus, Proceedings of the International Seminal on Mushroom Science, Horst, The Netherlands, 14-17, May, 1991:145-152.
3. H.C.Wang & Z.S.Wang,1989. The prediction of strain characteristics of Agaricus bisporus by the application of isozyme electrophoresis. Mushroom Science 12(1):87-100.
4. Z.S.Wang & H.C.Wang 1989. Study on the genetic variation of Agaricus bisporus, Mushroom Biotechnology, Proceedings of the International Symposium on Mushroom Biotechnology, Nanjing, China, 6-10, November, 1989:329-338.
5. Z.S.Wang & J.H.Liao 1990. Study on the crossbreeding techniques of Agaricus bisporus, Microl.Neotrop. Apl. (3): 1-12.
6. Z.S.Wang & H.C.Wang 1990. Isozyme patterns and charateristics of hybrid strains of Agaricus bisporus, Microl. Neotrop.Apl.(3):19-29.
7. Z.S.Wang, J.H.Liao, F.G.Li & H.C.Wang 1991. Studies on the genetic basis of esterase isozyme loci Est A,B and C in Agaricus bisporus, Mushroom Science 13(1):3-9.
8. 王泽生,1992,双孢蘑菇杂交育种研究进展,中国食用菌，11(4):10-12.
9. 王泽生,1991,应用同工酶电泳法分析双孢蘑菇白色菌株间的种内亲缘关系,福建食用菌，1(2):20-25.
10. 王振川,王贤樵,柯家耀,1990,双孢蘑菇栽培规程,蘑菇菌种及蘑菇罐头标准综合体,FDBT/QB 33.1-33.9-90, p.14-20.
Studies on breeding hybrid strain AS2796
of Agaricus bisporus for canning in China
Fujian Research Institute of Light Industry, Fuzhou, 350005, P.R.China
ABSTRACT: Using esterase isozyme as a genetic marker, some hybrid F1 progenies were obtained from 380 mating combinations which were made between homokaryotic cultures from the strains of high yield (type H) and those of good quality (type G). The hybrid F2 As2796 with characteristics of high yield, good quality and heat resistance was selected from 2000 monospores cultures isolated from the F1 progenies. As2796 has a typical heterozygous PAGE pattern, type HG4 of esterase isozyme, cultural behaviour similar to that of the parent 02 (type H2) and can fruit even at 24℃. Also, As2796 showed good stability fro five crops from 1990 to 1995 spread widely in China. Its average yield was 50-100% higher than that of the other parent 8213 (type G1), furthermore, its quality of mushroom was equal to that of 8213 and up to the national canning standards.
KEY WORDS: Agaricus bisporus, hybrid strain, high yield, good quality, heat resistance
