GB
中华人民共和国国家标准
GBxxxx--xxxx
双孢蘑菇菌种
SpawnofAgaricusbisporus(报批稿)
200x-xx-xx发布200x-xx-xx实施
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国家技术监督局 发布
前 言
栽培双孢蘑菇使用的菌种是人工培育的纯菌丝体及其培养基的混合体。我国采用三级扩大繁育程序（即母种、原种、栽培种）培育双孢蘑菇菌种。
为了规范我国双孢蘑菇菌种生产、经销和使用，确保我国双孢蘑菇生产持续健康发展，特制订本标准。
本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。
本标准起草单位：福建省轻工业研究所、福建省蘑菇菌种研究推广站。
本标准主要起草人：王泽生、廖剑华、曾辉、陈军、陈美元
1范围
本标准规定了双孢蘑菇（Agaricusbisporus）菌种的质量要求、试验方法、检验规则及标签、标志、包装、贮运等。
本标准适用于双孢蘑菇（Agaricusbisporus）的生产、流通和使用。
2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。在本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。
GB191－1990包装储运图示标准
GB4789.28－1994 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂
GB9687－1988食品包装用聚乙烯成型品卫生标准
GB9688－1988食品包装用聚丙烯成型品卫生标准
GB/T12728－1991 食用菌术语
3定义
本标准采用下列定义。
3.1母种 stockculture
经各种方法分离、选育或杂交得到的具有出菇能力的菌丝体纯培养物及其继代培养物。
3.2原种pre-culturespawn
由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。
栽培种spawn
由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。
3.4拮抗现象antagonism
具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线形边缘的现象。
3.5无棉塑料盖plasticstop
可代替塑料盖，带有某种高分子或纤维材料可满足滤菌和透气要求的塑料盖。
3.6玻璃菌种瓶glassspawnbottle
圆柱形，容积750mL，耐126℃高温，无色、淡绿色或淡兰色的透明玻璃瓶。瓶体总高190mm±2mm，瓶颈高25mm±1mm，瓶口外径40mm±1mm，瓶体外径82mm±1mm。
3.7塑料菌种瓶polypropylenespawnbottle
圆柱形，容积850mL，耐126℃高温，白色、半透明，卫生标准符合GB9688规定的塑料瓶。瓶体总高165mm±2mm，瓶颈高28mm±1mm，瓶口外径63mm±1mm，瓶体外径90mm±1mm。
3.8角变sector
因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。
3.9高温抑制线hightemperaturedline
食用菌菌种在生长过程中受高温的不良影响，培养物出现的圈状发黄、发暗或菌丝变稀弱的现象。
3.10同工酶isoenzyme
催化相同生化反应，而结构及理化性质不同的酶分子。通过凝胶电泳使同工酶分离成迁移率不同的区带，经生物化学染色后显示出的同工酶谱，可对生物品种进行酶分子水平的鉴别或鉴定。
4质量要求
4.1母种
4.1.1 容器规格采用18mmX180mm、20mmX200mm的玻璃试管。
4.1.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基），按GB4789.28中4.79规定配置。
4.1.3感官指标符合表1规定。
表1
项目要求
棉塞或无棉塑料盖干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求
培养基灌入量为试管总体积的十分之一至五分之一
培养基斜面长度为试管总长度的二分之一至五分之一
斜面接种块大小3~5mmX3~5mm
培养基斜面正面外观
菌丝体特征洁白或米白、浓密、羽毛状或叶脉状
菌丝体表面均匀、平整、无角变
菌丝分泌物无
菌落边缘整齐，无膏状、蜡状细菌或酵母菌菌落及霉菌菌落
培养基斜面背面外观培养基不干缩，颜色均匀、无暗斑、无色素
培养物气味有双孢蘑菇菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味
培养物镜检菌丝粗壮，无杂菌菌丝及孢子，无虫及虫卵。
4.1.4 菌丝生长速度在适温（24℃±1℃）下，15－20天长满试管。
4.1.5母种遗传和栽培性状供种单位，母种需经酯酶(Est)同工酶类型鉴定，确认其遗传类型与对照相
同后，需再经出菇试验确定产量及品质等栽培农艺性状合格后，方可用于扩大繁殖或出售。
4.1.5.1菌丝体Est同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳类型包括G型(呈现e1,e3特征带)、H型(呈现e2,e4和e30-33特征带)、HG1~HG2型(呈现e1,e3,e30-33特征带)和HG4型(呈现e1,2,3,4和e30-33特征带)等。以Est区带向正极泳动距离与溴酚蓝指示剂向正极泳动距离的比值作为电泳相对迁移率(Rm)。e1,e2,e3,e4,e30,e31,e32和e33的Rm值分别为0.820,0.810,0.760,0.750,0.128,0.100,0.070和0.010。
4.1.5.2菌丝萌发、定植能力接种到适合的培养基后，在正常条件下24小时内萌发恢复，定植迅速、菌
丝健壮，20天以内长满培养基。
4.1.5.3结菇转潮能力覆土后12～16天结菇，分布均匀；18～22天采菇，每潮菇间隔7～10天。
4.1.5.4抗逆性对温度、湿度、酸碱度等生长条件变化耐受能力较强；对主要病虫害的抵抗能力较强。
4.1.5.5生物学效率在正常条件下生物学效率不低于30%。
4.2 原种
4.2.1 容器规格玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶，分别符合3.6和3.7规定。
4.2.2 培养基
4.2.2.1 腐熟麦杆或稻杆(干)77%，腐熟牛粪粉(干)20%,石膏粉1%,碳酸钙2%,含水量62%±1%,pH7.5。
4.2.2.2腐熟棉籽壳（干）97%，石膏粉1%,碳酸钙2%,含水量55%±1%,pH7.5。
4.2.3 感官指标符合表2规定。
表2
项目要求
棉塞或无棉塑料盖干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求
培养基上表面距瓶口的距离50mm±5mm
接种量每支母种接原种4－6瓶
菌种瓶外观
菌丝体特征洁白浓密、生长旺健
培养物表面菌丝体生长均匀，无角变，无高温抑制线
培养基及菌丝体紧贴瓶壁，无干缩
培养物表面分泌物无
各种杂菌孢子、菌丝无
拮抗现象无
培养物气味有蘑菇菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味
培养物镜检菌丝粗壮、无杂菌菌丝和孢子、无虫及虫卵
4.2.4菌丝生长速度：原种瓶应发满菌丝，在适温（24℃±1℃）下菌丝长满瓶不超过45天。
4.3栽培种
4.3.1 容器规格：玻璃菌种瓶或塑料菌种瓶，也可采用不小于15cm×28cm，厚0.04mm-0.06mm的聚丙烯塑料袋。塑料袋的卫生标准符合GB9687和GB9688规定。
4.3.2 培养基除同4.2.2.1和4.2.2.2外，另可用以下两种。
4.3.2.1谷粒98%，石膏粉2%,含水量50%±1%,pH7.5～8.0。
4.3.2.2其它经省级或省级以上鉴定适合于双孢蘑菇菌丝生长的培养基。
4.3.3感官指标符合表3规定。
表3
项目要求
棉塞或无棉塑料盖干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求
培养基面距瓶（袋）口的距离50mm±5mm
接种量每瓶原种接栽培种30－50瓶（袋）
菌种瓶（袋）外观
菌丝体特征洁白浓密、生长旺健
不同部位菌丝体生长均匀，无角变，无高温抑制线
培养基及菌丝体紧贴瓶（袋）壁，无干缩
培养物表面分泌物无
各种杂菌孢子、菌丝无
拮抗现象无
培养物气味有蘑菇菌种特有的香味，无酸、臭、霉等异味
培养物镜检菌丝粗壮、无杂菌菌丝和孢子、无虫及虫卵
4.3.4菌丝生长速度栽培种瓶（袋）应发满菌丝，在适温（24℃±1℃）下菌丝长满菌种瓶（袋）不超过45天。
4.3.5种源应使用通过省级或省级以上菌种审定委员会审定、认定或登记的品种，并从具有相应技术资质的供种单位引种。
5抽样
5.1质检部门的抽样应具有代表性。
5.2母种按品种、培养条件、接种时间分批编号，原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。
5.3母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批菌种量的10%，5%，1%。但每批抽样数量不得少于10支、瓶（袋）；超过100支、瓶（袋）的，可进行两级抽样。
6试验方法
6.1感官检验
6.1.3表1、表2、表3中除接种量、培养物气味和培养物镜检三项外的各项，用肉眼或5X放大镜观察。
6.1.4表1、表2、表3中培养物气味，以鼻嗅判断。
6.1.5表1、表2、表3中培养物镜检，用放大倍数不低于10X40的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于30个视野。
6.1.6表2、表3中接种量，需察看菌种厂的生产纪录。
6.2细菌检验
取少量疑有细菌污染的培养物，按无菌操作接入GB4789.28中4.8规定的营养肉汤培养液中，25℃-28℃振荡培养1－2天，观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染；培养液澄清，为无细菌污染。
6.3母种遗传和栽培性状检验
6.3.1Est同工酶鉴定
取菌龄为15-20天的试管母种,刮取菌丝,按1:3:0.5的比例混合菌丝(g)、0.1Mol/L磷酸缓冲液(mL)和石英砂(g),研磨成匀浆,台式离心机10000r/min离心5min,取上清液,按5:1:1的比例混合上清液、40%蔗糖和0.01%溴酚蓝溶液作为电泳样品,4℃下冷藏备用。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。用pH8.9Tris-HCl缓冲液配制9%分离胶,用pH8.3Tris-甘氨酸作电极缓冲液。点样75uL,3℃下120V电泳20min后稳压200V,4h。用固蓝RR盐60mg,0.1Mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)80mLα-萘乙酯38mg和β-萘乙酯38mg溶于3mL丙酮配制的染色液染色,显现酶谱,再根据特征带分型。
6.3.2栽培性状
将被检母种制成原种。采用4.2.2.1的培养基配方（含水量提高到68%），配制360千克培养基,接种后分3组(每组2M2)进行常规管理，根据表4所列项目，做好栽培记录，统计检验结果。同时将该母种的出发菌株设为对照，亦做同样处理。对比二者的检验结果，以时间计的检验项目中，被检母种的任何一项时间较对照菌株推迟5天以上（含5天）者，为不合格；产量性状差异显著低于对照菌株者，为不合格；菇体外观形态与对照明显不同或畸形者，为不合格。
表4
检验项目检验结果检验项目检验结果
母种发满所需时间，天
转潮间隔时间，天
原种发满所需时间，天
总产，Kg
栽培种发满所需时间，天
平均单产，Kg
菌种萌发所需时间，天
平均单菇重，g
菌丝发满培养基所需时间，天
生物学效率，%
覆土至扭结所需时间，天
菇型、色泽
覆土至采菇所需时间，天
菇盖直径、厚度、柄长、柄的直径，mm
6.4留样
各级菌种要留样备查，留样的数量应每个批号母种3-5支，原种和栽培种5-7瓶，于4℃-6℃下贮存，母种5个月，原种4个月，栽培种2个月。
7检验规则
7.1判定规则按质量要求进行。检验项目全部符合质量要求时，为合格菌种，其中任何一项不符合要求，均为不合格菌种。
8标志、包装、运输、贮存
8.1标志
8.1.1产品标志每支、瓶（袋）菌种要贴有清晰注明以下要素的标志。
a.产品名称（双孢蘑菇母种）
b.品种名称（As2796）
c.生产单位（xxx菌种厂）
d.接种日期（2000.xx.xx）
8.1.2包装标志每箱菌种要贴有清晰注明以下要素的包装标志。
a.产品名称、品种名称
b.厂名、厂址、联系电话
c.出厂日期
d.保质期、贮存条件、执行标准
e.发货单位
f.收货单位
g.数量
h.毛重、净重
i.执行标准
8.1.3包装储运图示按GB191规定，应注明以下图示标志：
a.小心轻放标志
b.防水防潮防冻标志
c.防晒防高温标志
d.防止倒置标志
e.防止重压标志
8.2包装
8.2.1 母种外包装采用木盒或有足够强度的纸材制做的纸箱，内部用棉花、碎纸、报纸等具有缓冲作用的轻质材料填满。
8.2.2 原种、栽培种外包装采用有足够强度的纸材制做的纸箱，每箱20瓶，内部用碎纸、报纸等具有缓冲作用的轻质材料填满。纸箱上部和底部用8cm宽的胶带封口，并用打包带捆扎两道，箱内附产品合格证书和使用说明（包括菌种种性、培养基配方及适用范围）。
8.3 运输
8.3.1 不得与有毒物品混装。
8.3.2 气温达30℃以上时，需用2℃-20℃的冷藏车运输。
8.3.3 运输中须有防震、防晒、防雨淋、防冻、防杂菌污染的措施。
8.4贮存
8.4.1 母种一般在5℃±1℃冰箱中贮存，保藏期不超过90天。
8.4.2 原种应尽快使用，10天内可在温度24℃±1℃、清洁、通风、干燥(相对湿度70%-75%)、避光的室内存放。在5℃±1℃下贮存，保藏期不超过40天。
8.4.3栽培种应尽快使用，在温度24℃±1℃、清洁、通风、干燥(相对湿度70%-75%)、避光的室内存放谷粒种不超过10天，其余培养基的栽培种不超过20天。在5℃±1℃下可贮存90天。
