桑黄孔菌属真菌（Sanghuangporus），俗称桑黄，隶属于担子菌门、蘑菇纲、锈革孔菌目、锈革孔菌科，是在我国具有悠久应用历史的药用大型真菌。目前，桑黄孔菌属共有19个物种，其中11种在我国有分布。随着我国桑黄产业的持续发展，将与桑黄形态相近物种充当桑黄进行销售的欺诈行为屡见不鲜，扰乱了桑黄产业的市场秩序。更为严峻的是，由于韩国、日本、泰国等大中华文化圈国家对桑黄的高度认可，我国的桑黄资源面临一定程度的流失风险。因此，急需开发一种可以针对桑黄孔菌属真菌进行快速检测的方法，以保护桑黄这一重要战略生物资源的安全，促进桑黄产业的健康发展。
本研究首先将桑黄孔菌属，以及Fuscoporia、Inonotus、Phellinus、Tropicoporus等形态近似属的内部转录间隔序列（ITS）进行比对，并在ITS1区域设计了桑黄孔菌属的特异性引物和探针（图1）。随后选取我国的11个桑黄物种、及12个形态和分类关系与桑黄相近的物种，进行引物和探针特异性验证。经验证，在第35个循环周期前，11个桑黄物种均出现扩增曲线，12个近缘种和空白对照均无扩增曲线，表明特异性引物和探针可有效检测我国桑黄物种（图2）。
图1：我国桑黄孔菌属真菌特异性引物和探针在ITS1区域的位置（红框表示正向引物S-F和反向引物S-R的位置，绿框表示探针的位置，深蓝色区域代表在我国桑黄孔菌属所有物种中的一致序列）。
图2：基于qPCR的特异性引物和探针在检测我国11个桑黄物种的特异性表现。
进一步选用在桑黄产业中应用最广泛的三个物种，即鲍姆桑黄（S.baumii）、桑树桑黄（S. sanghuang）和杨树桑黄（S.vaninii），优化特异性引物和探针的浓度。结果发现，特异性引物和探针的浓度越高，Ct值越低，荧光强度越强。综合考量特异性引物和探针的合成成本，在20 µL的qPCR体系中，将0.7 μmol/L作为引物的最佳工作浓度，0.5 μmol/L作为探针的最佳工作浓度（图3）。使用最佳工作浓度的特异性引物和探针，重新对qPCR的扩增特异性进行了评估。发现最佳工作浓度的特异性引物和探针在检测我国桑黄物种中仍表现良好。尤其值得注意的是，最佳工作浓度下的特异性引物和探针可在更短的qPCR循环周期内特异性检测出我国的桑黄物种（图4）。
图3：桑黄孔菌属真菌特异性引物和探针浓度优化。（A）引物在不同工作浓度下的循环阈值,（B）引物在不同工作浓度下的相对荧光单位,（C）探针在不同工作浓度下的循环阈值,（D）探针在不同工作浓度下的相对荧光单位。
图4：基于qPCR的特异性引物和探针在最佳浓度下检测我国11个桑黄物种的特异性表现。
同样选择S.baumii、S.sanghuang和S.vaninii，测定基于qPCR快速检测反应的灵敏度。分别将三个物种的DNA浓度进行梯度稀释，即10 ng/μL、1 ng/μL、10-1 ng/μL、10-2 ng/μL、10-3 ng/μL、10-4 ng/μL、10-5 ng/μL和10-6 ng/μL，分别采用浓度优化前后的引物和探针进行灵敏度检测，结果发现最佳浓度引物和探针的灵敏度相较优化前有所提高，其最低检出限的DNA模板浓度为10-3ng/μL（图5）。
图5：基于qPCR的我国桑黄孔菌属真菌快速检测方法的灵敏度。（A、B、C）原始浓度特异性引物和探针的灵敏度，（D、E、F）最佳浓度特异性引物和探针的灵敏度（编号1-3表示DNA模板浓度为10 ng/μL、4-6为1ng/μL、7-9为10-1ng/μL、10-12为10-2ng/μL、13-15为10-3ng/μL）。
综上，本研究基于qPCR技术首次开发了快速检测我国桑黄孔菌属真菌的方法，相关研究结果已申请专利一项（已受理），并于2024年10月20日，以Development and optimization of the qPCR-based rapid detection method for Chinese species of Sanghuangporus为题，在线发表于LWT-Food Science and Technology期刊。中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室与辽宁大学联合培养硕士研究生赵静为本文第一作者，周丽伟研究员为通讯作者，博士研究生王雪蔚、助理研究员姜霁航和副研究员刘世良也参与了研究工作。感谢北京林业大学戴玉成教授、吉林农业大学图力古尔教授、台中自然博物馆吴声华研究员、中国科学院沈阳应用生态研究所魏玉莲博士提供的桑黄样品，感谢中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室李善魁同学、赵鹏副研究员在研究过程中给予的帮助！本研究得到国家重点研发计划（No. 2022YFC2601200）的资助。
全文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643824012064
