摘 要
比较双频 (23/25 kHz、23/28 kHz) 和三频 (23/25/28 kHz) 超声组合提取对大球盖菇 (Stropharia rugosoannulata) 蛋白质含量及氨基酸组成、理化特性及蛋白质生物学功能的影响。结果表明，23/25/28 kHz 提取的蛋白质含量 (64.71%) 最高，23/25 kHz增加蛋白质衍生产物肽分子的热稳定性，23/28 kHz提取的蛋白质分子粒径最小。三频超声组合通过相近频率叠加及协同增强超声空化效应和机械作用，引发细胞结构损伤和氧化应激，通过加速降解损伤蛋白质与抑制蛋白质合成相结合，促进蛋白质释放、溶解与转化，实现比双频更高效的提取效果。研究从理化特性到分子功能，解析超声提取大球盖菇蛋白质的频率协同作用机制，为大球盖菇蛋白质的开发提供参考。
1 研究背景与方法
大球盖菇 (Stropharia rugosoannulata) 子实体富含蛋白质、多糖及氨基酸等多种生物活性成分，蛋白质含量高达50% (干重)，且含有人体必需的多种氨基酸，具有显著的降血压、抗氧化及免疫调节等生理活性。随着全球对功能性食品及替代蛋白质需求的增长，食源性蛋白质的开发利用成为研究热点。但在大球盖菇组织中，蛋白质常与膳食纤维以复杂的交联状态存在，加之提取效率低、活性损失等问题，限制了其工业化应用。
超声波作为一种非热加工技术，其空化效应和机械效应产生的协同作用，可提高目标成分提取效率，并通过结构改性提升其功能特性。已有研究表明，在23~28 kHz单频条件下超声提取的大球盖菇蛋白质含量最高 (47%~49%)，但不同频率组合的协同作用机制，及其对蛋白质含量、氨基酸组成、理化特性和生物学功能的影响尚未明确。
本研究采用双频 (23/25 kHz、23/28 kHz) 和三频 (23/25/28 kHz) 超声组合提取大球盖菇蛋白质，在相同功率与处理时间下，系统比较蛋白质含量及氨基酸组成、热稳定性、二级结构、荧光光谱、粒径与微观形貌，并结合蛋白质组学技术解析关键蛋白质信息及其富集通路，旨在阐明多频超声对大球盖菇蛋白质提取、分子结构与生物学层面的影响机制，为其在替代蛋白质及功能性食品中的开发应用提供理论参考。
2 结果与分析
2.1 蛋白质含量及氨基酸组成
由图1A可以看出，23/25/28 kHz三频提取样品的蛋白质含量最高，达到 (64.71±0.50) %，其与双频23/25 kHz提取样品相比具有显著性差异 (P<0.0001)。三频和双频超声提取样品的水解氨基酸均有17种，氨基酸种类齐全；谷氨酸是所有超声提取样品中的主要氨基酸，其次为脯氨酸 (三频样品中) 和丙氨酸 (双频样品中) (图1B)。结果表明，不同频率超声组合对蛋白质含量及氨基酸组成均产生显著影响。
图1 双频和三频超声提取物的蛋白质含量（A）及氨基酸占比（B）
2.2 蛋白质理化特性
热稳定性方面，各样品DSC图谱均产生两个明显的热吸收峰。在41~57 ℃出现肽的热吸收峰，134~136 ℃出现蛋白质的热吸收峰。其中23/25 kHz提取样品的多肽变性温度最高 (57.30 ℃)，说明该组合对多肽稳定性有提升作用 (图2A)。
二级结构方面，各样品均以β-折叠和无规则卷曲占比较高，分别为29%~35%和41%~43%；双频样品的α-螺旋占比 (13%~15%) 高于三频样品 (约11%)，而三频样品的β-折叠占比 (34.04±1.99)%较双频 (29%~31%) 略有增加，表明三频频率协同效应对二级结构影响更显著，蛋白质分子结构更松散 (图2B)。
荧光光谱方面，各样品最大发射峰均位于440 nm处；23/28 kHz双频样品荧光峰强度较高，说明色氨酸对频率差异较大 (相差5 kHz) 的双频组合更为敏感 (图2C)。粒径分布方面，各样品粒径均在450 nm以下，其中23/28 kHz平均粒径最小，为 (271.73±9.09) nm；三频样品出现轻微聚集，粒径增至 (379.1±13.10) nm，推测与更多基团暴露、局部重新交联有关 (图2D)。
原子力显微镜观察显示，23/25 kHz、23/28 kHz和23/25/28 kHz提取样品聚集体最高高度分别为37.85、18.33和14.00 nm。三频作用促使样品局部交联明显但整体颗粒分布相对均匀；23/28 kHz的较大频率差减弱了分子间交联，样品状态更为疏松 (图2E)。
图2 双频和三频超声提取蛋白质的理化特性分析（A. DSC；B. 圆二色谱；C. 荧光光谱；D. 粒径；E. 原子力显微镜）
2.3 蛋白质生物学功能
对鉴定得到的1 671种蛋白质进行偏最小二乘法判别分析 (PLS-DA)，三频提取样品分布在第三象限、双频样品分布在第二象限，不同频率组合提取样品可被有效区分 (图3)。
图3 蛋白质分子量分布及 PLS-DA分析（注 A. 蛋白质分子量分布图；B. 蛋白质偏最小二乘法判别分析）
差异表达蛋白质 (DEPs)分析表明，在23/25/28 kHz vs. 23/25 kHz比较组中鉴定到DEPs 373种 (上调186、下调187种)；在23/25/28 kHz vs. 23/28 kHz比较组中鉴定到246种 (上调131、下调115种)；两个比较组共有的上调、下调特征性DEPs分别为73、83种 (图4)。这些特征性DEPs均由三频频率协同作用产生。
图 4 三频与双频提取样品比较组中上调（A）和下调（B）差异表达蛋白质分析
对73种上调特征DEPs的富集分析发现，糖酵解/糖原异生、谷胱甘肽代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、蛋白酶体、磷酸戊糖途径等通路显著富集，涉及能量供应、氧化应激防御和蛋白质再生；同时β-氨基己糖苷酶、糖苷水解酶家族5蛋白质等细胞壁水解酶上调，有利于细胞壁疏松和内容物释放 (图5A)。
对83种下调特征DEPs的分析显示，被抑制的通路指向蛋白质合成 (核糖体、氨酰-tRNA生物合成)、蛋白质折叠与加工 (内质网中的蛋白质加工) 以及中心碳与能量代谢 (TCA循环) 等耗能过程 (图5B)。由此从蛋白质组学层面揭示了三频超声通过“降解上调＋合成下调”双向调控促进蛋白质释放的机制。
图5 特征差异表达蛋白质（上调，A；下调，B）与功能富集通路相关性分析
3 讨论
已有研究表明，超声处理可以提升蛋白质产量、改变分子二级结构、减小分子粒径，从而提高蛋白质理化特性及生物活性。在超声物理场能量传递上，单频超声能量场时空分布往往不均匀，易形成局部过强或过弱的剪切区域，导致提取不完全或局部变性。
本研究中，双频模式通过两个频率交替叠加，利用较大频率差增强空化强度：频率差较大的23/28 kHz能更有效解离蛋白质聚集体、显著减小分子粒径并促进色氨酸残基暴露。三频超声 (23/25/28 kHz) 则通过三个相近频率的协同效应，构建更为连续、均匀的复合声场，增强空化与机械作用，从而提升蛋白质含量，并诱导二级结构发生显著变化。
蛋白质组学结果进一步表明，三频超声不仅破碎细胞外围结构，更深入损伤线粒体、内质网，引发氧化应激。一方面上调细胞壁降解酶、蛋白酶体和抗氧化通路，加速受损蛋白质降解；另一方面为节省能量而下调核糖体生物合成与蛋白质折叠等耗能过程。这种“加速降解”与“抑制合成”的双向响应，深度扰乱了细胞内稳态，使蛋白质释放更彻底，实现比双频更高效的提取效果，为大球盖菇蛋白质作为替代蛋白质的开发应用提供了参考。
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