兰 进 贺秀霞 汤以佳 徐锦堂 朱永懿
（中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所, 北京, 100094;
中国农业科学院原子能利用研究所, 北京,100094）
摘 要 ：用3H一葡萄糖对紫萁小菇进行氚标记，然后用标记的紫萁小菇伴播天麻种子，观察发现标记紫萁小菇仅由天麻胚柄状细胞侵入，在天麻种胚细胞中同化的标记化合物由细胞壁进入并由胞压运输到细胞内，形成原球茎后同化标记物由维管组织运输。
关键词 ：天麻种子; 标记紫萁小菇; 放射性自显影
前言:
天麻（Gastrodia elata Bl．）属兰科（Orchidaceae）非自养型植物。其种子构造简单，无胚乳及其它营养贮备，仅由胚及种皮构成。研究发现天麻种胚细胞中含有一些多糖及脂肪等营养物质，但不足以提高种子萌发的营养。试验证明，无外源营养供给，天麻种子不能发芽，蜜环菌对天麻种子萌发有明显的抑制作用。徐锦堂等从天麻发芽原球茎中分离到12种可供天麻种子发芽的萌发菌菌株，其中确认紫萁小菇（Mycena osmundicola Lange）菌是最优良的一种，这一突破性的进展，使天麻种子发芽率提高30-40％。天麻有性繁殖研究也进入了一个新阶段。徐锦堂等利用光学显微镜及电子显微镜对天麻消化紫萁小菇的过程进行了大量观察研究。这些工作多是建立在双方相互作用解剖特征基础上，缺少对作用双方物质运输途径的研究。本文在前人研究基础上，采用连续切片进行光镜放射性自显影观察，追踪标记紫萁小菇及同化产物在天麻种胚中的轨迹，了解标记物在天麻种胚及原球茎中积累运输情况，为系统地揭示天麻生长发育规律提供理论依据。
1 材料与方法
1.1材料 同位素标记化合物
H一葡萄糖［D一（6-H-glu）］，由中国科学院上海核技术研究所提供，比活度30Ci／mmol。
1.2方法
1.2.1菌种标记培养
母种菌种培养：配制PDA培养基。马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂18g，水1000ml,按常规配制，pH5.5。经高压灭菌后，在无菌条件下，将培养基分装无菌试管中，每管2 ml，25℃放置2d。无菌条件下溶化加入H一葡萄糖，引入剂量50μci／ml，摇匀，摆成斜面培养基。用60Coγ辐照灭菌。25℃培养2d，确认无杂菌污染后，接入紫萁小菇菌种，25℃培养，15d后转接二级菌种。
树叶菌种培养：将青杠树落叶洗净，摆放到培养皿中的海棉上，加水，高压灭菌后，接入标记的一级菌种，25℃培养，20d后可播种。
1.2.2标记紫萁小菇伴播天麻种子 实验所用天麻种子采自药用植物研究所真菌室经人工授粉结的果实。在无菌条件下，将天麻果抖出种子，播种到染有紫萁小菇的菌叶上。
1.2.3样品制备
光镜样品制备：取被标记紫萁小菇侵染的天麻种子及由种子萌发形成的原球茎，用水反复冲洗．用5O% EDTA浸洗2min，再流水冲洗。分别用FAA液固定24h，经清洗，系列梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，常规石蜡切片，切片厚度7～8μm。切片经祷片、脱蜡、复水后，移入暗室涂布乳胶。
自显影制备：暗室红灯下，取定量的核一4乳胶（北京401研究所研制），置于无离子水洗净的乳胶杯中，以一定浓度水杨酸钠溶液作增感剂，在42℃恒温水浴中搅拌15min，静止片刻．在乳胶涂布箱中，用涂布法在已脱蜡的切片上涂布核乳胶膜，晾干，置切片于暗盒中，加硅胶干燥袋，密封，置4℃冰箱中曝光20d。
显影、定影：切片曝光后，用D-19b显影液显影3min，停影后，用F-5酸性坚膜定影液定影20min，流水冲洗，稍晾干，经系列梯度酒精脱水，同时用番红一固绿二重染色，最后，用光学树脂封片，待观察。
6. 结果与分析
标记紫萁小菇伴播天麻种子后，在菌丝侵入初期，标记物大量集中分布于天麻胚柄状细胞中，表明紫萁小菇菌丝仅由天麻胚柄状细胞侵入胚体，标记菌丝形成菌丝结出现在胚柄状细胞上部2～3层原胚细胞中，同时发现显影银粒在胚柄状细胞以上的原胚细胞和顶端分生细胞中，在原胚细胞中显影银粒多分散在多糖颗粒上，表明胚柄状细胞上部2～3层原胚细胞具有消化、分解萌发菌的能力并将其同化产物通过细胞壁及胞压运输到上部原胚细胞及顶端分生细胞中。观察还发现在胚柄状细胞上部4～5层原胚细胞中，不形成菌丝结，紫萁小菇菌丝被完全消化，在这些细胞中有大量显影银粒存在，在胚顶上层原胚细胞分解、消化吸收，被同化的标记物由胞压作用，通过细胞间传递达到顶端分生细胞中。分生细胞获得营养，分裂旺盛，胚体膨大，突破种皮而萌发，形成原球茎。原球茎分化产生营养繁殖茎，并分化出维管组织，在新形成的维管组织中发现大量显影银粒，表明随着种胚的发育，维管组织的形成，天麻种胚消化萌发菌获得的营养物质是通过维管组织进行运输，以满足其生长的需要。
3.讨论
通过放射性自显影观察标记紫萁小菇同化物的踪迹，表明天麻胚柄状细胞具有分解、消化菌丝的功能，当分生细胞开始分裂后，种胚顶端分生组织中已云集大量同化的标记化合物，在天麻种胚没有形成原球茎前，同化紫萁小菇的营养物质靠细胞壁及胞压作用，进行传递和输送，当顶端分生细胞开始分裂，突破种皮而萌发，形成原球茎，随着组织的分化，同化标记物由维管组织运输，从理论上进一步证明天麻种子萌发靠同化侵入的紫萁小菇获得营养。在新形成的营养繁殖茎维管组织中也发现了许多显影银粒，说明紫萁小菇不仅在天麻种子发芽及原球茎形成时供给营养，而在分化出营养繁殖茎及营养繁殖茎生长阶段，都需要从萌发菌获得营养。这些同化的标记物如何参与天麻种子萌发与原球茎形成的新陈代谢过程及其超微结构的变化还有待于借助电子显微镜放射性自显影技术进一步观察研究。
参考文献
冉砚珠，徐锦堂. 1988.蜜环菌抑制天麻种子发芽的研究.中药通报, 13（10）15～17
徐锦堂，冉砚珠，郭顺星. 1990.天麻种子发芽营养来源的研究.中国医学科学院学报, 12（5）：431～434
徐锦堂，郭顺星. 1989.供给天麻种子萌发营养的真菌-紫萁小菇. 真菌学报, 8（3）：221～226
徐锦堂，牟春，冉砚珠. 1990.天麻种子萌发动态及紫萁小菇菌丝侵入的细胞学观察. 中国医学科学院学报, 12（5）：313～317
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