灵芝胞外多糖高产菌株筛选及其深层发酵培养基的优化
宋频然，常继东(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237)
灵芝(Ganoderma zucidum)隶属于担子菌纲(BaSidiomycetes)，多孑L菌目(PolyporaleS)，多孔菌科(Polyporaceae)，灵芝属(Ganoderma)，是中医药宝库中的珍品，药用历史悠久。灵芝的现代研究始于20世纪50年代末，半个世纪以来，在真菌化学、药理作用、人工驯化、栽培技术、液体发酵和产品加工等方面都有长足的进展[1-5]。灵芝液体发酵研究主要集中于提高菌丝体、灵芝多糖和灵芝酸的产量[1,6-8]，而对灵芝液体发酵菌种的选育研究甚少[8-10]。应用自身代谢终产物耐受性原理进行抗生素高产菌株筛选的筛选模型已普遍被应用，但应用蕈菌胞外多糖的反馈抑制原理筛选蕈菌胞外多糖高产菌株的研究尚未见报道。本文应用灵芝胞外多糖反馈抑制原理[11]构建了一个筛选模型，并用它筛选37株灵芝菌株，检出一株强耐同源胞外多糖反馈抑制、产胞外多糖能力最强的灵芝菌株GL029，进而优化GL029的深层发酵培养基。
1材料与方法
1．1耐反馈抑制筛选模型的构建
1．1．1构建筛选模型的理论依据、
在灵芝液体发酵过程中，自身终产物胞外多糖(EPS)具有反馈抑制作用。对菌株GL002(韩芝2号)来说，培养液中EPS的浓度高于0．59g／L时，EPS的产生受到明显抑制，其趋势是随着培养液中EPS浓度的增加，反馈抑制作用逐渐增强。当EPS浓度达到2．34g/L时，菌丝的生长和EPS的产生完全被抑制，即该菌株对自身代谢终产物EPS的最大耐受浓度为2．34g/L[11]。将该浓度的同源灵芝胞外多糖添加到液体培养基中，对若干灵芝菌株分别进行同步深层发酵，凡不能生长者，则其对自身终产物EPS的耐受浓度小于2．34dL，反之则高于2．34g/L。耐受性越强，其EPS的生产能力也越强。
1．1．2筛选模型指示因子
GL002菌株于30℃、120r／min避光培养9d，然后用醇沉法[11]提取胞外多糖(EPS)，所得灵芝胞外粗多糖即为筛选模型指示因子。
1．1．3筛选模型指示因子提取培养基
培养基配方为蔗糖30g，酵母浸膏1g，(NH4)2S041g，KH2P04?7H20 1g，KCl 0．5g， FeS040．01g，水1000mL。
1．1．4筛选培养基
培养基配方为蔗糖30g，酵母浸膏1g，(N地)2S041g，KH2P04?7H20 1g，KCl 0．5g， FeS040．01g，浓度为2．34g/L筛选模型指示因子的水溶液1000mL。
1．1．5筛选培养
将4℃保藏的出发菌株置常温下活化后，接种至PDA斜面，28℃避光培养7d。然后接种到PDA平板，28℃避光培养5d。平板种子接入灭菌后装有100mL筛选培养基的500mL摇瓶中，每个摇瓶用φ6mm的打孔器接种平板种子12块，种子皆取自菌落边沿区域。于30℃、120r／min避光培养9d。
1．1．6筛选检测
当筛选培养进入第6天时(对数期为第2天至第6天[1l])，检查摇瓶中菌丝生长情况，则可直接淘汰既未生长、又无染菌的菌株。做相关纪录。有菌丝生长者，则继续培养至终点，用醇沉法[11]提取胞外多糖(EPS)，稀释至80倍，用硫酸一酚法[12,13]测定其浓度。比较指示因子数值，检出强耐反馈抑制菌株。
1．1．7筛选模型的模拟运行和验证
从37株出发菌株中随机选取5株，按照1．1．5的方法分别接入1．1．3的筛选模型指示因子提取培养基和1．1．4的筛选培养基，进行同步筛选培养，从接人筛选模型指示因子提取培养基中的5个菌株中检出胞外多糖产量最高的菌株。从接入筛选培养基中相同的5个菌株中检出强耐反馈抑制菌株，比较两种筛选方法所得结果的一致性，以确定筛选模型的可行性和可靠性。
1．2强耐反馈抑制作用胞外多糖高产菌株的检出
1．2．1出发菌株
37株出发菌株的编号为GL001、GL002、GL003、GL004、GL005、GL006、GL007、GL008、 GL009、GL010、GL011，GL012，GL013、GL014 、 GL015、GL0161 GL017、GL018 、 GL019、 GL020、 GL021、GL022、GL023、GL024、GL025、GL026、GL027、GL028、GL029、GL031、GL032、GL033、 GL034、GL035、GL036、GL037、GL039，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室保藏。
1．2．2筛选操作
将37株出发菌株中除已在耐反馈抑制筛选模型模拟运行试验中输入该模型的5株之外
的32株菌株，按照既定程序输入该模型，考察其表现，统一比较37株出发菌株的耐反馈抑制作用强度，检出一株耐受性最强的菌株，即为胞外多糖高产菌株。
1．3既得灵芝胞外多糖高产菌株深层发酵培养基的优化
1．3．1基础培养基
基础培养基配方为蔗糖10g，酵母浸膏lg,KH2P04?7H2O 0．5g，水1000mL。
1．3．2正交试验设计
根据灵芝深层发酵的营养需求，本试验在基础培养基的基础上，选取碳源(玉米粉)、氮源(蛋白胨)、钾(氯化钾)、硫酸镁四因素，每因素设三个水平(表1)。选择无交互作用的正交表L9(3 4)[14,15]将四因素任意地排列在四个列号的任何列上，进行既得胞外多糖高产菌株深层发酵培养基优化研究(表2)。
2结果与分析
2．1耐反馈抑制筛选模型及其操作法
2．1．1耐反馈抑制筛选模型的结构
根据1．1．1构建筛选模型的理论，经多次试验，确立了耐反馈抑制筛选模型框架，它包括筛选指示因子、筛选培养基、筛选培养、筛选检测四部分，外围结构为出发菌株。结构关系如图1所示。
2．1．2筛选操作程序
通过出发菌株GL002深层发酵获取的筛选指示因子仅供2d内备用。准备好筛选模型指示因子和出发菌株的平板种子之后，才制备筛选培养基。时间掌握不好，易出现种子老化和筛选模型指示因子感染杂菌。然后把出发菌株平板种子接到筛选培养基中。当筛选培养进行到第6天时，直接淘汰未感染杂菌而菌丝不生长的菌株：继续培养在筛选培养基中能生长的出发菌株至设定的终点，测定筛选培养醪中灵芝胞外多糖总浓度，其中，胞外多糖总浓度最高的菌株就是耐反馈抑制作用最强的、灵芝胞外多糖高产菌株。
2．1．3耐反馈抑制筛选模型的模拟运行与验证
从37株出发菌株中随机选取的GL007、GL010、GL017、GL026和GL033五株菌株分别接人筛选模型指示因子提取培养基和筛选培养基，进行同步筛选培养。耐反馈抑制作用筛选模型试运行结果与指数比较试验结果的比较见表3。由表3可见，用耐反馈抑制筛选模型选出的强耐反馈抑制作用的菌株与用指数比较试验选出的胞外多糖产量最高的菌株是一致的，都是GL033，证明模型可行而且可靠。
2．2灵芝胞外多糖高产菌株的检出
2．2．1初筛
输入耐反馈抑制筛选模型的37株出发菌株菌丝生长情况见表4。由表4可见，其中28株无菌丝生长，即予以淘汰。检出GL006、GL011、GL018、GL025、GL028、GL029、GL031、 GL033和GL039九株耐反馈抑制作用较强的菌株(即有菌丝生长者)进行复筛。继续培养至设定终点，测定培养醪中胞外多糖的浓度。
2．2．2复筛
所得9株耐反馈抑制作用较强菌株复筛培养基中的胞外多糖总浓度见图2。由图2可见，GL029培养基中的胞外多糖浓度最高，即其产胞外多糖能力最强。
2．3 既得灵芝胞外多糖高产菌株 GL029深层发酵培养基的选优
2．3．1正交试验结果
用GL029菌株作正交试验，其正交试验结果见表5。由表5中的Dmax值(因子引起的极大偏差)的比较可见：DA>Dc>DB>DD。即在基础培养基中添加的四因素对GL029胞外多糖产量影响的强度依次为玉米粉、氯化钾、蛋白胨和硫酸镁。比较表5中的K值可得：KA2>KAl>KA3；KR2>Ka3>KBt；Kc2>Kc3>Kc1；KDI> Km>KD2，即四因素的最佳搭配为： A2 B2 C2D1。
2．3．2试验结果单因素分析
以不同浓度的玉米粉、蛋白胨、KCl和MgS04作为单因素，其对灵芝胞外多糖产量的影响结果见图3～图6。
由图3可见，在基础培养基中添加适量的玉米粉可以提高灵芝胞外多糖产量，但过量的玉米粉会降低灵芝胞外多糖产量，这可能是玉米粉添加量太大，导致培养基过稠，溶氧下降，不利于菌丝生长和灵芝胞外多糖的产生。在提取灵芝胞外多糖时发现，添加玉米粉30g／L的培养基比添加玉米粉15g/L的培养基要稠，其菌丝浓度也不如玉米粉浓度较低者。
由图4可见，在基础培养基中添加适量的蛋白胨作为氮源，可提高灵芝胞外多糖产量，如果添加过量，会导致灵芝胞外多糖产量下降，这可能是因为氮源过于丰富，导致菌丝疯长，而不利于灵芝胞外多糖产量的提高，只有碳氮比合适的培养基才有利于目标代谢物质的积累。
由图5可见，基础培养基要维持一定浓度的K+，才有利于提高灵芝胞外多糖的产量。
由图6可见，在基础培养基中添加硫酸镁对灵芝胞外多糖的产量有影响，但影响不大。虽然镁和硫是菌丝生长必需的，可影响胞外多糖的产量，但在本试验中，可能是基础培养基中的酵母浸膏和因素A(玉米粉)中含有的镁和硫已足以满足胞外多糖合成的需要，所以添加的硫酸镁对胞外多糖产量影响不大。
单因素分析结果与表5中Dmax值的比较结果一致。
四因素对胞外多糖产量影响的方差分析见表6。由表6可见，a=O．10时，四个因素对胞外多糖产量的影响皆显著；α=O．05时，A、B、C三个因素对胞外多糖产量的影响显著；a=O．01时，只有A、C二个因素对胞外多糖产量的影响显著。
统计分析结果表明，在基础培养基中添加的四因素最佳搭配水平是A2 B2C2D1，即玉米粉15∥L，蛋白胨2g/L，Ka 0．5g/L，MgS040g/L。本研究的9个试验未采用四因素的这一水平搭配，因为正交试验仅仅选做一部分因素水平搭配[15]。在采用水平搭配A2B2D1的5号试验中，灵芝胞外多糖产量高达3．05g/L。结合本试验基础培养基配方综合考虑可见，组合碳源和组合氮源比单一碳源和单一氮源更有利于提高灵芝胞外多糖的产量。所以，菌株GL029用于生产灵芝胞外多糖的最适培养基，即在本试验的基础培养基配方中添加水平搭配为A2 B2 C2D1的4个因素，其配方为蔗糖10g／L，玉米粉15g／L，蛋白胨2g／L，酵母浸膏1g/L，Ka 0．5g/L， KH2P04?7H20 0．5g/L，水1000mL，pH自然。将GL029菌株接入以此配方配制的培养基，于30℃、装量100mL／500mL、摇床转速120r／min摇瓶培养9d，该菌株的胞外多糖产量达3．07g/L。高于正交试验中5号试验的产量．表明本优化研究结果可信可靠。
3讨论
3．1本研究首次应用灵芝胞外多糖的反馈抑制作用原理-1¨构建了耐反馈抑制筛选模型，并用该模型从37株灵芝菌株中筛选出一株强耐自身代谢产物胞外多糖反馈抑制、高产胞外多糖的灵芝菌株GL029。本研究所构建的模型不仅为选育用于深层发酵的灵芝优良菌株提供了新的途径，而且大大提高了选育菌种的效率。
3．2本研究对既得耐胞外多糖反馈抑制作用的灵芝菌株GL029的深层发酵培养基进行了优化。结果表明，组合碳源和组合氮源比单一碳源和单一氮源更有利于提高灵芝胞外多糖的产量。以最适配方培养基，起始pH自然，培养温度30℃，装量100mL／500mL，摇床转速120r／min培养9d，该菌株的胞外多糖产量达3．07g/L，高于目前国内文献报道的最高产量2．91g/ L[16]。
3．3本试验已对既得菌株GL029进行了摇瓶培养基优化，其发酵罐发酵工艺过程控制及其优化则有待进一步研究。
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