2023年4月28日，我国第一个基因编辑生物安全证书授予舜丰生物的基因编辑大豆，预示着基因编辑育种在我国的规范化和逐步合法化。目前虽然在多种食药用菌中成功构建了CRISPR/Cas9系统，但多数物种仅限于技术的可行性，靶基因多限于URA3/pyrG，少数应用于代谢产物合成通路解析等，未对影响表型或性状改良的基因进行编辑，即未能在菌种选育中得到应用。
2022年中国科学院微生物研究所董彩虹研究员团队在蛹虫草中建立了无痕的CRISPR/Cas9基因编辑体系，可实现单、双基因的高效无痕编辑和精准敲除，为蛹虫草基因编辑育种奠定基础（Meng et al., 2022; https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35829671/），而遗传学和育种研究中基因敲入与敲除同样重要。
外源基因的插入往往会影响靶位点基因、侧翼邻近基因的表达以及染色质状态，进而对宿主产生不良影响。基因组安全位点（Safe harbor）为外源基因提供一个安全可靠的停泊“港口”，使得外源基因既可以稳定高效表达，同时不会导致宿主产生任何可识别的表型变化。以基因组、转录组数据为基础，在蛹虫草基因组中鉴定出多个安全位点，通过CRISPR/Cas9系统对其进行敲除和敲入验证，得到第一个可用的安全位点CmSH1。在此基础上，构建了一种安全位点靶向的CRISPR/Cas9基因敲入系统，通过简单的一步克隆连接即可构建敲入载体，实现基因过表达或外源基因在安全位点的定点整合。利用该系统对蛹虫草疏水蛋白基因Cmhyd1进行定点过表达，基因编辑菌株“白毛病”抗病性增强，对蛹虫草农艺性状影响微弱且不影响其子实体商品性。PCR测序和基因组重测序确认Cmhyd1过表达菌株无脱靶和外源基因、序列残留。
2023年10月，该研究结果以“Safe-Harbor-Targeted CRISPR/Cas9 System and Cmhyd1 Overexpression Enhances Disease Resistance in Cordyceps militaris”为题在Journal of Agricultural and Food Chemistry杂志在线发表。
本研究获得了食用菌基因组中第一个安全位点，实现了基于CRISPR/Cas9系统的基因定点敲入。本研究也是无痕基因编辑获得的第一例抗病菌株，为其他食用菌抗病育种提供借鉴，对病害的防控具有重要的科学意义和实践价值。该研究目前已经申请专利（专利申请号：202211257442.5）。本工作主要由博士生研究生刘晴完成，得到国家重点研发项目（2022YFD1200602）和国家自然科学基金面上项目（31872163，32272786）的资助。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.3c05131
