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    学术前沿:食用菌品种精准鉴定的新方法MNP分子标记:以香菇为例


    【发布日期】:2022-10-11  【来源】:易菇网  【作者】:凌云燕
    【核心提示】:多核苷酸多态性(Multiple Nucleotide Polymorphism,MNP)标记法是继简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)标记法和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)标记法后,于2020年成为植物品种鉴定的另一个国家标准(GB/T38551-2020)。

    我国作为全球最大的食用菌生产国,多年来年产量3500万吨以上,占世界3/4,同时食用菌产业在循环农业和促进农民增收方面成效显著,已成为我国特色农业发展中的朝阳产业。近年来随着食用菌品种选育、种质交流和引种栽培等工作的快速推进,在生产和科研中面临食用菌品种名称繁多,同物异名,异物同名现象普遍存在的问题。然而现有的品种鉴定方法大多存在工作量大、精确性和重复性不足等问题,极大影响了产业发展和种质创新进程。

    多核苷酸多态性(Multiple Nucleotide Polymorphism,MNP)标记法是继简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)标记法和单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)标记法后,于2020年成为植物品种鉴定的另一个国家标准(GB/T38551-2020)。其基本原理是在基因组内存在多个SNP位点,将这些不同SNP位点的等位基因型组合起来,用于区分不同的个体DNA。目前MNP标记已成功应用于水稻、大豆、油菜、茄子、玉米、番茄等作物的品种鉴定。因为MNP标记法在筛选目标区段时避开了易出错的序列,如SSR和连续的SNP位点;其次,基于高通量测序的MNP标记检测克服了凝胶电泳中SSR扩增长度的不确定性和SNP标记的微阵列杂交噪声;MNP位点会通过二代测序重复检测上千次,重现性和准确性都会得到提升。此外当构建完成具体物种的MNP标记位点数据库后,在实验操作上只需要将待测样品DNA和混合MNP标记引物在一次PCR体系中扩增,并测序这些位点的序列即可,所以检测的实际操作非常便捷。

    虽然MNP标记技术在植物品种鉴定方面已取得了明显成效,但由于植物的基因组显著大于真菌基因组,此外食用菌普遍采用组织分离法复壮菌株或采用系统选育法育种,使得食用菌品种同质化非常严重,不同品种(菌株)之间亲缘关系极为密切,所以食用菌品种鉴定的标准和精确程度要求更高。此外不同品种的形态和性状对不同栽培条件较为敏感,使得品种的准确鉴定难度进一步增大。

    在本研究中,我们在植物品种MNP标记研究方法的基础上,针对食用菌品种鉴定的实际需求和难点,开发出适合食用菌品种鉴定的方案和流程。以我国食用菌总产量第一,品种名称超过500个的香菇[Lentinula edodes (Berk.) Pegler]为材料,在188个菌株基因组重测序数据的基础上,筛选得到501个广泛MNP标记位点;通过相关引物设计和对78份香菇商业品种(包括25个国家品种委员会认定的香菇商业栽培品种、7个通过地方审定(鉴定、备案)品种、以及具有代表性状、生物学特性和来自不同地域的栽培菌株)的多重扩增、MNP-Seq测序,构建了我国香菇品种的MNP标记位点数据库。通过检测,它们的位点检出率、重复率和准确率分别为94.4%、99.92%和99.96%,表明其标记效果良好。在此基础上进一步筛选187个核心MNP标记位点,并利用240个菌株的核心位点序列构建高精度的系统发育图谱(图1),并计算不同谱系间和品种间遗传相似度(Genetic Similarity,GS,表1)。

    研究结果表明:1)所有供试的栽培品种可以被区分为24个谱系:其中13个谱系的原始栽培品种来自日本,5个谱系来自中国(其中1个来自台湾),3个谱系目前来源不明。综合所有结果,除了唯一来自中国南方的栽培品种(香九)外,大多数香菇栽培品种原产于东北亚地区,中国的香菇品种存在严重的同质化现象。2)划定了区分不同谱系和品种的GS标准:当GS值小于或等于94%,为不同谱系的品种;GS值在94%-99.5%之间,可以被认为同一谱系中不同的栽培品种;当GS值高于99.5%时,则视为同一栽培品种。3)进一步完善了香菇品种精准鉴定的快速流程,实现简单的实验室操作(只需对待测样品一次DNA提取,一次多重PCR扩增,一次送样测序)后,通过MNP数据库比对即完成待测样品的品种精准鉴定。

    本研究开发了香菇品种鉴定的广泛MNP标记数据库,并在此基础上筛选出核心MNP标记,建立了香菇栽培品种的谱系图、谱系和品种鉴定的标准流程及区分标准,实现精准快速鉴定香菇品种。此项工作为强化食用菌品种的原始创新(初始品种),鼓励修饰性品种创新(派生品种),奠定了技术保障平台。

    图1  基于187个核心MNP序列的香菇系统发育图谱

    表1  香菇参试品种的遗传相似度(GS值)

    相关论文在真菌领域权威期刊Mycosphere(2022年影响因子16.525,JCR 1区)在线发表,中国科学院微生物研究所硕士生凌云燕和博士生张明晢为该论文共同第一作者,湖北省农业科学院经济作物研究所王卓仁高级农艺师和中国科学院微生物研究所赵瑞琳研究员为论文共同通讯作者,江汉大学彭海教授、福建农林大学吴小平教授为共同作者。研究工作得到了国家重点研发计划项目(2018YFD0400200),国家自然科学基金项目(31961143010, 31970010)、北京市食用菌创新团队(BAIC05-2022)、中科院农业先进微生物技术工程实验室(KFJ-PTXM-016)和河南省重点研发项目(221111110600)的资助。

    相关论文链接Doi 10.5943/mycosphere/si/1f/3;专利受理号202210530743.4。

     
    关键词: 真菌
     
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