（3）器械分离法：应用显微操作器，直接挑选单孢子，移至PDA 平板中进行孢子刺激萌发培养，获得单孢纯种。
①孢子悬浮液制备：同稀释分离法，孢子浓度控制在1000个/毫升；
②平板涂布：将稀释后的孢子悬浮液滴0.1毫升于平板上，用无菌的T氏棒进行均匀涂布，每个平板含孢子大约100个左右；
③镜检分离：待涂布均匀的平板琼脂表面水分干燥后即可于显微镜下观察，当在视野中心见到孢子，而视野周围无其它孢子时，可用显微操作器操纵玻璃针把孢子从培养基表面挑取，随后把孢子转移至PDA平板的表面上，进行孢子萌发培养，孢子萌发培养须使用蘑菇气生菌丝刺激培养，才能提高萌发率，培养的具体操作方法与涂布分离法相同。
（4）单孢子菌落接待：当孢子经过10天的刺激培养， 肉眼可见到菌丝生长而成小菌落，应及时用打孢子器把该菌落分离，每天都应观察孢子萌发情况， 如果不及时把菌落移接，该菌落会快速生长而影响较迟萌发单孢子的分离。
二、组织分离法
组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯菌丝的方法。组织分离系一种无性繁殖法，双亲的染色体没有经过重组，因此组织分离基本上可保持亲本的生物不特性，棒操作简便，取村广泛，在过去传统的稳定菌株中常采用此方法进行菌种的分离，退化不明显，但是随着蘑菇杂交菌种的应用，由于杂种本身所具有的不稳定，组织分离常造成菌株的退化，目前生产上很少采用，只是进行野生菌株分离时，才比较常用。其方法如下：
①挑选种菇：其标准与孢子收集要求相同；
②菇体消毒：将子实体菌柄基部切除，置接种箱内，用75%酒精对菇体表面进行消毒；
③组织分离：解剖刀经火焰灭菌，在菇柄中部纵切一刀， 用手掰开菌再用接种铲在菇盖与菇柄交界处切五个小方块，随后挑取一小块组织，迅速移接到PDA斜面培养基上，置24℃下培养，待组织块长出菌丝无污染即为纯种。
