栽培种，又叫生产种，即把原种再次扩接到栽培种培养基上，经过培育得到的菌丝体。培育双孢菇栽培种多以麦粒为原料，具有制作简单、发菌快、易于播种的优点。(1)原料处理
牛粪破碎处理后过筛，按1:1.2加水拌匀，堆积发酵，每天翻堆一次。约20天牛粪粉变为褐色，具有正常发酵草料的清香气味，晒干备用。无受潮的小麦，充分泡透后捞出，适当遮阳、通风，发现表皮发干时轻喷细雾湿润，24小时后即可发芽。待麦芽长至1～2厘米时，即可使用。
选择无虫蛀的小麦，倒入沸水中煮20～25分钟（水用石灰调ph值8～9），捞去秕麦等漂浮杂物并不断搅拌，煮至麦粒无白心时，立即停火将麦粒捞出，切忌将麦粒表皮煮破。在水泥地面晾至表面无水迹。
(2)基质配制
配方为麦粒（以干品计）100千克、牛粪粉30千克、石膏粉1千克、碳酸钙1.5千克。将麦粒与牛粪粉按1：0.2混合，同时拌入其他辅料，注意使牛粪全部粘附到麦粒上，水分不足时适量喷水。剩余牛粪粉待用。
(3)装瓶灭菌
装料可用长28厘米、宽15厘米、厚5丝的聚丙烯折角袋。小批量生产多利用酒瓶、葡萄糖玻璃瓶等，装瓶灭菌。为降低生产成本，可用500毫升输液瓶。先装一把牛粪粉在瓶底，1～1.5厘米高，再装麦粒。装瓶时稍墩瓶，使麦粒至瓶肩以下1厘米处，然后再装入1～2把牛粪粉，并用工具摊平、压实。将瓶口处的杂物擦洗干净，塞入棉塞。
采用高压灭菌方法，压力维持在0.15兆帕，保持2～2.5小时。灭菌结束后，压力下降至零后，可取出料瓶，降温至30℃时即可接种。
(4)菌种培养
双孢菇菌丝的适宜生长温度为22～26℃，因此，培养室内应尽量保持此温度，坚决避免出现30℃以上的温度，以免细菌污染。同时培养室还要遮光，保持室内黑暗。在培养期间，要利用夜间通风，保持室内空气新鲜；每隔3～4天，喷洒一次杀菌剂与杀虫剂；每7～10天检查1次，挑出被杂菌污染的菌种，保持菌种的纯度。正常情况下，25～30天菌丝即可长满全瓶，继续培养3～5天，就可用于生产。
(5)剔杂处理
接种后第3天即开始检查剔杂，发现任何非双孢菇菌丝的菌瓶，随即移出室外。有链孢菌污染的，应用方便袋从上往下套住菌瓶，慢慢移出。对一般杂菌的污染，可喷施药物后将料倒出，晒干后再次利用；对链孢菌污染，应远离培养室倒料，并予焚烧或深埋。空瓶用70℃以上热水烫杀，洗净后再用。
经35～45天菌种完成发菌，暂时不用的菌种应低温存放，一般保持2～4℃条件即可。
