Introduction
自1987年发现硫酸多糖具有抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)的活性以来，硫酸多糖受到了关注。硫酸多糖有广泛的生物活性，包括抗氧化剂、抗血管生成、抗肿瘤、抗补体、抗炎和其他类肝素活性。多糖的生物活性与化学结构和物理性质密切相关，硫酸酯化基团具有空间位阻和静电排斥作用，可以改变多糖的原始结构，使糖链呈较伸展状态，提高其在水中的溶解度，也会进一步改善其生物活性。比如，一种来自木层孔菌的β-葡聚糖(PRP)的两种硫酸酯化衍生物(PRP-S1和PRP-S2)在体内都有显著的抗肿瘤活性。与空白对照相比，PRP还显示出对肿瘤生长的抑制作用。来自该菌的另一种硫酸酯化葡聚糖对单疱疹病毒表现出较强的抗病毒活性，而相应的未衍生化多糖则无活性。
大球盖菇是北温带最著名的食用菌之一，具有令人愉悦的清新、酥脆的质地，并伴有轻微的甜味。大球盖菇还对高血糖、破骨细胞形成抑制、抗真菌作用、内质网应激抑制活性、抗肿瘤、抗癌等具有有益作用。它含有多种生物活性物质，如多酚、多糖和膳食纤维。有研究表明，从大球盖菇子实体中分离出中性多糖(SRP-1)和酸性多糖(SRP-2)。SRP-1和SRP-2均具有(1 → 6)-α-D-葡聚糖主链，但SRP-2具有比SRP-1更强的抗氧化能力。我们之前研究了在大球盖菇胞外多糖(EPS)的制备过程、大球盖菇的最佳发酵培养条件以及发酵过程中各项参数和生物量的变化与EPS产量之间的关系。并且证明了大球盖菇胞外多糖具有一定的体外抗肿瘤活性和体内降血糖活性，但是在抗氧化活性实验中效果较差，该EPS在3.0 g/L时的DPPH和羟基自由基清除率仅达到20%~30%。为了提高大球盖菇胞外多糖的抗氧化活性，进一步制备了硫酸酯化衍生物，并对其体外抗氧化活性进行了研究。
Results and discussion
大球盖菇胞外多糖及其硫酸酯的化学结构
大球盖菇胞外多糖EPS和其硫酸酯化衍生物S-EPS的FT-IR光谱如图1所示，红外结果表明多糖具有β-糖苷键，吸收峰在1 731cm−1左右证实了羧酸根的存在，说明EPS应为一种酸性多糖。与EPS相比，S-EPS的FT-IR光谱中出现两个新的特征吸收峰。1 211 cm−1处为硫酸跟S=O的拉伸振动， 796 cm−1处为C–O–S弯曲振动，说明引入了硫酸根基团。S-EPS中的硫酸根含量约为17.95%，计算出取代度(DS)为2.12.DS值较高，这与FT-IR光谱数据一致，表明硫酸酯化成功。图2显示了EPS硅烷化分析的GC/MS总离子流图。EPS主要由葡萄糖(54.8%)、甘露糖(28.8%)、葡萄糖醛酸(13.8%)以及少量其他糖残基组成。这与FT-IR结果一致，表明EPS是一种酸性杂多糖。
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图2 EPS的总离子流色谱图
如13C NMR光谱(图3)所示，在异构碳区，发现有两个主要信号，化学位移分别为95.2和102.4 ppm，这证明EPS同时含有α-构型和β-构型糖苷键。结合峰强度和红外、质谱结果，可以判断EPS主要由β-葡萄糖和α-甘露糖组成。C4和C6向低场位移(分别为δ73.2~73.8和68.0~68.1)，表明EPS含有(1→4)链接和(1→6)链接。一般来说，多糖不同羟基的反应活性为C-6>C-2>C-3>C-4.与C-2和C-4上的羟基相比，C-6上的羟基与硫酸基的亲和力为10 倍。根据本研究中的DS值为2.12.EPS的大部分2-OH和6-OH应被硫酸酯化。如图2所示，C-6信号出现在59.5~0.5 ppm处，衍生后向66.1~66.6 ppm移动，C-2信号出现在72 ppm处，衍生后向73.6~73.9 ppm移动，这也证实了EPS的2-OH和6-OH基本被硫酸酯化。总的来说，EPS主要由β-葡萄糖和α-甘露糖组成，糖苷键类型主要为(1→4)链接和(1→6)链接。S-EPS的取代位置分别为C-2和C-6.
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大球盖菇胞外多糖及其硫酸酯的链构象
天然高分子的分子量以及链构象等参数，对其生物活性也有重要的影响。本工作采用SEC-MALLS-RI测定了EPS和S-EPS的分子量和链构象。如表1所示，EPS和S-EPS的重均分子量(Mw)确定为2.1×104 Da和1.4×104 Da，表明硫酸酯化反应过程中多糖发生一定程度的降解，这应该是由磺化试剂氯磺酸引起的。多分散指数(Mw/Mn)是分子质量分布宽度的量度，可以看出S-EPS具有比EPS更高的分散性。然而，S-EPS在0.1 mol/L NaCl水溶液中的分子半径(Rg)大于EPS。说明衍生化后的S-EPS发生降解，分子链段从原来相对致密的结构打开，采用了更为舒展的链构象，分子尺寸反而增加。Mw/Mn的增加也表明衍生化后EPS的链断裂导致分散度的增加和分子量分布的展宽。
表1
基于聚合物稀溶液理论，第二维利系数A2为溶液中溶质-溶质和溶质-溶剂相互作用强度的重要指标。如果A2>0.溶剂-溶质相互作用有利;A2<0时，溶质-溶质相互作用有利，可能导致聚集或沉淀。在25 ℃下通过SEC-MALLS检测0.9% NaCl水溶液中的EPS和S-EPS的A2值。两者 A2均接近零，但在衍生化之前为负值，表明溶质-溶质相互作用有利，可能导致EPS分子轻微聚集。多糖衍生后，A2值变为正值，表明溶剂-溶质相互作用有利，说明S-EPS在0.9% NaCl水溶液中具有更好分散溶解效果。总的来说，硫酸酯化后EPS降解为分子量较小的S-EPS，分子尺寸反而变大，亲水性也更好。
大球盖菇胞外多糖及其硫酸酯的抗氧化活性
由于担心合成抗氧化剂在食品和其他领域潜在的生物毒性，人们越来越关注用天然抗氧化剂替代合成抗氧化剂。在天然抗氧化剂中，多糖在清除自由基方面起着重要作用。本工作测定了EPS和S-EPS对DPPH和羟基自由基的清除活性，结果如图4所示。所有样品的自由基清除活性均呈浓度依赖性。EPS和S-EPS对DPPH自由基的清除率均表现出相对较差的效果，它们具有相似的剂量依赖性(P<0.05)，最终在质量浓度为5 mg/mL时达到23.1%。随着EPS浓度的增加，其羟基清除率呈稳步上升趋势(P<0.05)，当质量浓度为5 mg/mL时，最终达到35.8%。S-EPS的羟基自由基清除活性显著高于EPS，在质量浓度为4 mg/mL时，其清除活性是EPS最高值的两倍以上(72.1%)。
图4 E
羟基自由基清除机制与金属离子的传递有关。因此，能够螯合金属离子并使其失去活性的抗氧化剂分子可以清除羟基自由基。 S-EPS对羟基自由基的清除能力高于EPS，表明硫酸酯化修饰可以提高清除羟基自由基能力。S-EPS具有较强的抗氧化能力，这可能是由于其更舒展的空间结构。有研究表明，水溶性和分子量也是提高真菌葡聚糖某些生物活性的重要因素。比如，冬虫夏草多糖硫酸酯衍生化后具有更高的水溶性、更低的分子量和更强的生物活性。另外，硫酸基团可能在溶液中产生高酸性环境，使其更易通过静电捕获自由基。然而，在实验浓度范围内，EPS及其硫酸酯对•DPPH的清除率均较差，这与其他多糖及其硫酸酯的清除率相似。这也可能是由于多糖对两种自由基的不同清除方式或者检测方案等原因所致。比如，在常规的DPPH自由基清除实验过程中需要添加乙醇，而乙醇作为多糖的不良溶剂，可能会导致多糖链在溶液中聚集，从而大大降低多糖对DPPH自由基的清除能力。
Conclusion
采用醇沉法从大球盖菇发酵液中提取了一种酸性胞外多糖(EPS)。采用氯磺酸-吡啶法合成了EPS的硫酸化衍生物(S-EPS)。通过FT-IR、NMR和SEC-MALLS-RI对EPS和S-EPS的化学结构和链构象进行了表征。FT-IR结果表明硫酸酯化修饰成功。EPS主要由甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，糖苷键类型主要为(1→4)链接和(1→6)链接。EPS的C6和C2的羟基在衍生化过程中被硫酸酯化。硫酸酯化制备了分子量较小、分子尺寸较大、亲水性较好的S-EPS。此外，硫酸酯化衍生物S-EPS对羟基自由基的清除能力优于EPS，有效地提高了抗氧化活性。
作 者 简 介
第一作者
郝辉，男，硕士，高级工程师，现为河南中烟工业有限责任公司技术中心主任工程师，主要研究方向为烟草化学基础研究、烟用材料应用研究以及新型烟草产品设计与开发。获省部级科技进步二等奖2项、三等奖2项。在国内外期刊公开发表科技论文40余篇，其中第一作者或通讯作者论文11篇，获授权国家发明专利20余件。参与制定国家标准1项、行业标准4项。
通信作者
高明奇，男，河南中烟技术中心材料研究所副主任，高级工程师，研究方向主要包括新型材料、烟草化学、增香保润等，近年来，参与3项烟草行业重大专项、20余项地厅级重点科研项目，获省部级科技奖励2项、地厅级科技奖励10项，参与制定行业标准3项，发表科研论文40余篇，授权发明专利30余件。
许春平，男，荷兰格罗宁根大学博士，教授，博导，河南省“百人计划”特聘专家，河南省高层次人才B类，河南省高校科技创新人才，行业内烟草工业生物技术重点实验室学术委员会委员，四川省、江西省、安徽省科技奖励评审专家，担任Biotechnology and Bioprocess Engineering(SCI收录)与Journal of Biologically Active Product From Nature编委。现任郑州轻工业大学国家烟草局烟草工业生物技术重点实验室副主任，郑州轻工业大学科协副主席。主要从事生物化工和烟草工程研究。近年来，主持国家自然科学基金2项、省厅项目8项和河南中烟、广西中烟、重庆中烟等企业横向课题20余项，发表论文180余篇，其中SCI收录120余篇，中科院一区12篇、二区20篇，高被引论文8篇，。出版学术专著11部，其中英文图书4部。获得河南省科技进步二等奖一项，三等奖二项，中国烟草总公司科技进步二等奖一项，河南省教育厅科技成果一等奖二项，授权国家发明专利16件。
Sulfation of the extracellular polysaccharide from the edible fungus
Hui Haoa, Chun Cuia, Yuqing Xingb, Xuewei Jiab, Bingjie Mab, Wenyi Kangc, Tianxiao Lib, Mingqi Gaoa,*, Chunping Xub,*
a China Tobacco Henan Industry Co. Ltd., Zhengzhou 450000. China
b College of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450000. China
c National R & D Center for Edible Fungus Processing Technology, Henan University, Kaifeng 475004. China
*Corresponding authors
Abstract
An acidic extracellular polysaccharide (EPS) was gained from Stropharia rugosoannulata fermentation broth by the alcohol precipitate method. Sulfated derivative of EPS (S-EPS) was gained by chlorosulfonic acid-pyridine method and the conditions were as follows: pyridine as the reaction solvent, temperature 80 ℃, and reaction time 90 min. The chemical structure and chain conformation of EPS and S-EPS were characterized by FT-IR, NMR and size exclusion chromatography (SEC) coupled with multi-angle laser light scattering (MALLS) detection. FT-IR spectra indicated the sulfated group was linked to the polymer. The EPS mainly consists of mannose, glucose and glucuronic acid, and the glycosidic bond type is mainly (1→4)-linked and (1→6)-linked. C6 and C2 were substituted by sulfate groups. The EPS was degraded into smaller molecular weight (Mw) polysaccharides with the larger molecular size (Rg) after sulfation and S-EPS has better hydrophilicity. Moreover, the sulfated derivative S-EPS was found to have a better scavenging ability on hydroxyl radicals than EPS. It proved that the chemical modification of S. rugosoannulata polysaccharides by sulfation effectively enhanced their antioxidant activity.
Reference:
HAO H, CUI C, XING Y Q, et al. Sulfation of the extracellular polysaccharide from the edible fungus Stropharia rugosoannulata with its antioxidant activity[J]. Journal of Future Foods, 2023. 3(1): 37-42. DOI:10.1016/j.jfutfo.2022.09.006.
