利用可以在人工条件完成整个生活史的蛹虫草菌种,分离、鉴定了2个蛹虫草菌株子囊孢子的单孢分离物,对子囊单孢的配对培养和子实体诱导结果显示,蛹虫草具有典型的二极性异宗配合习性。
子囊菌;A蛹虫草;A交配型;A异宗配合
蛹虫草[Cordyceps militaris (L.) Link]又名北冬虫夏草,分类学上属真菌门(Eumycota),子囊菌亚门(Ascomycotina),核菌纲(Pyrenomycetes),球壳目(Sphaeriales),麦角菌科(Clavicepitaceae),虫草属(Cordyceps)[1]。虫草属真菌是一类具有重要药用和开发价值的真菌,其中冬虫夏草[Cordyceps sinensis (Berk.)Sacc.]为我国传统名贵滋补中药材,由于野生资源稀少,价格极其昂贵,许多科研单位对其子实体人工培养进行了大量的研究工作,但至今尚未能规模培养[2~7]。蛹虫草作为虫草属真菌的模式种,具有与冬虫夏草相似的药理功效,且人工规模培养已经成功,正逐渐成为冬虫夏草的重要替代品,具有广阔的市场前景。目前有关蛹虫草的研究,主要集中于培养条件选择、有效成分分析和药理作用研究上[8~20],对其基本生物学、遗传学等方面的研究仍较薄弱[21~24],对其交配型的研究几为空白[25]。
真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性生殖的遗传基础。已知真菌的交配型系统分为同宗配合和异宗配合2大类。同宗配合是一种自体可孕的有性生殖方式,即该真菌不需要两个不同来源的菌丝交配,只由同一有性孢子萌发生成的初级菌丝就可独立完成有性生活史。同宗配合分成初级同宗配合(primary homothallism)和次级同宗配合(secondary homothallism)。异宗配合是一种自体不孕的有性生殖方式,即由同一有性孢子萌发形成的初级菌丝不能独立完成有性生活史,只有通过两个不同交配型的有性孢子萌发生成的初生菌丝之间的交配,才能完成有性生活史。异宗配合根据控制交配型的不亲和性因子是一对还是两对,也可分为两类:具有一对不亲和性因子的二极性异宗配合(bipolar heterothallism)和具有两对不亲和性因子的四极性异宗配合(tetrapolar heterothallism)。就同一菌株所产生的有性孢子间的交配而言,二极性异宗配合菌的可亲和率为50%,而四极性异宗配合菌的可亲和率为25%,这是判断是否二极性或四极性异宗配合的基本依据。在已研究的担子菌中,约有90%的种属于异宗配合真菌,其中,约有25%为二极性异宗配合真菌,75%为四极性异宗配合真菌[26,27]。而对子囊菌,现有报道种类中同宗配合占较大比例[27],但研究较多的粗糙脉孢菌(Neurospora crrassa)则为典型的二极性异宗配合真菌(A, a)[28] ;由于缺少像担子菌中的锁状联合一样的简易判断标准,子囊菌关于交配型的研究比较困难而且报道较少。本文利用能在人工条件下完成全部生活史、并能较容易地分离到子囊孢子单孢的蛹虫草菌种,率先进行了其交配特性的研究,旨在丰富对子囊菌的交配特性的认识,为虫草属内不同真菌的交配特性研究提供参考。
1 材料与方法
1.1κ匝椴牧
实验所用的2个蛹虫草菌株C.m.H-07ZY1和C.m.H-04G13s9均采自长白山区,为本实验室在大量分离纯化和筛选基础上获得的能成功培养出正常子实体的菌株。
1.2ε嘌基
PDA培养基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1000 mL,用于菌种分离和保存;
PDB培养基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖20 g,水1000 mL,用菌种液体培养;
米饭培养基:25 g大米加35 g水,高压灭菌后作为子实体培养基。
高新华:蛹虫草(Cordyceps militaris)的交配型研究
1.3ψ邮堤迦斯づ嘌方法
将在PDA斜面活化的蛹虫草菌种接种于PDB液体培养基中(75 mL/250 mL),转速150 rpm、25 ℃下振荡培养3 d,再将所得的液体菌种稀释(约100倍)转接于瓶装米饭培养基上(4 mL/瓶),瓶盖中垫上滤纸,以避免空气交换可能引发的污染,于25 ℃暗培养3~4 d,当观察到菌丝已明显在培养基表面开始蔓延时,转至光培养室,光照强度以室内散射光为准,培养温度调至22 ℃。培养18 d左右,子实体原基开始出现,50~55 d左右,子实体成熟并开始弹射子囊孢子。
1.4ψ幽益咦拥ユ叻掷
取蛹虫草成熟子座,倒置固定于不相接触的PDA培养基上方,使子囊孢子可以弹射到培养基平板上。22 ℃恒温培养2~3 d后,分别挑取子囊单孢菌落转接至PDA斜面上,22 ℃恒温培养,待菌丝长满斜面后保存备用。
1.5ψ幽业ユ叻掷刖株的配对及子实体诱导
将分离得到的单孢菌丝转接于PDB液体培养基中25 ℃振荡培养3~5 d,将所得液体单孢菌种单独接种于米饭培养基上培养以诱导产子实体,即为单孢培养产子实体试验;将所得液体单孢菌种两两配对混合后接种于米饭培养基上培养以诱导产子实体,即为配对培养产子实体试验。每个培养样品10个重复,子实体诱导培养方法如1.3中所述。
1.6ν核体和异核体的鉴定
从单孢菌株的培养和配对结果看,单孢分离菌株与亲本菌株菌丝生长无明显差异,菌株之间也没有明显形态方面的差异,结合子实体诱导试验结果,本实验将菌株是否能形成子实体作为区分同核体和异核体的标准,即正常条件下不能形成子实体的单孢分离株为单核的单孢分离株,而产生子实体的则不是。以此标准,单核体交配后产生子实体的是亲和性交配,不产生子实体的则为不亲和性交配。
2 结果与分析
2.1ψ幽益咦拥ユ叻掷虢峁
通过对C.m.H-07ZY1菌株的子囊孢子单孢弹射分离及转管培养,得到9个子囊孢子单孢菌株。对这些菌株进行诱导子实体验证培养,结果其中8个不能产子实体,1个能产子实体,且子实体形态正常,子囊壳丰富。对C.m.H-04G13s9菌株的子囊孢子单孢弹射分离及转管培养,得到11个子囊孢子单孢菌株,进行子实体诱导培养,结果10个菌株不能产子实体,1个菌株能产子实体,且子实体形态正常,子囊壳丰富。
在实验中镜检弹射的子囊孢子时,有时能观察到2个或多个子囊孢子扭结在一起未能经弹射分离成单孢的情况(见图1),由此,笔者认为以上能产子实体的分离菌株不是子囊孢子的单孢菌株,而是分离中误取的2个或多个子囊孢子扭结的混合菌株。这种情况若不加以区别,将对交配结果带来极大误差,也说明得到确凿可靠的子囊孢子单孢是子囊菌中交配型研究的一个很重要前提。由于许多子囊菌的异核菌丝(在担子菌中也称为次级菌丝,即有性孢子经过有效配对融合后形成的菌丝)在子囊菌生活史中能够存活很长时间,若不能取得纯子囊孢子单孢菌株,就可能把已经异宗配合后的异核菌丝误认为子囊孢子单孢菌株,给交配型研究结果带来极大误差。为避免上述误差,本实验只采用经过验证不能产子实体的菌株作为下一步单孢配对试验的菌株。
2.2ψ幽益咦拥ユ呔株配对培养结果
将从C.m.H-07ZY1分离得到的8个单核体菌株两两配对培养诱导子实体,结果见表1。按交配的结果可将这些单核体分为两组,组内菌株间不亲和,而组间亲和,表1中分别用A和a标记其交配因子类型,这样清楚反应出蛹虫草具有二极性异宗配合习性,不同交配型菌株在发生亲和性反应形成双核体菌丝后具有良好的可育性,产生子实体并形成丰富的子囊壳。
