一、孢子分离法
蘑菇孢子分离法，是利用成熟子实体的有性担孢子能自动从子实体层中弹射出来的特征，在无菌条件下和适宜的培养基上，使孢子萌发成菌丝，获得纯种的一种方法。孢子分离可分为单孢分离和多孢分离法两种，由于是从有性担孢子（是指其细胞核已经地核配过程）分离纯菌丝体，因此生产上多采用多孢分离法来保持菌株的原有特性，而单孢分离法主要应用于菌株的筛选和杂交育种等工作，孢子分离主要分为两个步骤，首先是采集孢子，其次进行单孢或多孢子分离。
（一）采集孢子
1、种菇的选择 采集孢子首先要选好种菇即分离用的子实体。一般蘑菇种菇要求是第一潮菇，出菇较早，单生，个体健壮，特征典型的子实体，经过仔细的观察筛选后在菇床上做个记号，让种菇充分生长，直至即将破膜时将菇采摘进行孢子弹射。
2、孢子弹射收集 种菇采收后可浸入0.1%升汞溶液中消毒约一分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用无菌滤纸把表面水吸干，或直接用75% 酒精棉球轻轻控拭菌盖及菌柄进行表面消毒。随后用无菌刀切掉多余菌柄（约留下1.5-2cm即可），把菇直立，菇柄朝下插入铝线制作的支持物上，放入了先准备好铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上钟罩（如图 所示）。这套孢子收集装置需事先进行高压灭菌消毒。把装好子实体的孢子弹射收集器放在温度为15-20℃的室内，经24-48小时左右， 可见到无菌滤纸上有褐色的蘑菇孢子印。在无菌操作下把收集到蘑菇孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，并在温度下进行真空干燥，之后放入冰箱可长期保存备用。
（二）孢子分离
1、多孢分离法 即把多个孢接种在同一培养基上，让它们萌发共同生长交错在一起，从而获得纯种的一种方法，由于多个孢子间的种性互补，基本上可以保持亲本的稳定性，此法比较简易，在过去的蘑菇制种中应用较为普遍。
（1）斜面划线法：按无菌操作规程，用无菌接种环从收到孢子的滤纸条上沾取少量孢子，在PDA试管斜面培养基上自下而上划线，划线时勿用力， 以免划破培养基表面，接种完毕，抽出接种种灼烧试管口，塞上棉塞，放置24℃恒温培养箱中培养，待孢子萌发后（一般约15-20天），挑选萌发快，长势旺的菌落， 转接于新试管培养基上再行培养。
（2）涂布分离法：按无菌操作方法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴1-2滴到PDA试管或培养皿培养基上，转动试管使孢子悬浮液均匀分布于斜面上，或用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子在培养基上经24℃恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称，生长速度快的菌落，移接于另一试管斜面培养基上，恒温培养即为母种。
