堆积发酵将配方中的各种材料混合在一起，让其腐熟发酵的过程。其目的为：使各种好热性微生物在堆料中繁殖，把培养材料中的纤维素、半纤维素、木质素分解为蘑菇菌丝可以利用的化合物;所加入的氮素营养物质被各种微生物利用后，变成微生物的蛋白质，当微生物死亡后，菌体也就成了蘑菇可利用的有机氮;发酵过程中释放的热可以杀死料中的病虫杂菌;经过发酵，堆料变得柔软、疏松、通气，具有优良的物理状态。
1、堆料前的准备：粪肥应晒干，不要淋雨，若来不及晒干，则可挖坑倒入，拍紧，密封。用干粪堆积效果好，牛粪最好晒干至半干时粉碎成粉状，再晒干透。稻草、麦秆等材料需选用新鲜、无霉烂的，使用前须切割成20-30cm长的小段，以便其吸水，也便于翻堆。
2、培养料的二次发酵：蘑菇培养料堆积腐熟发酵一般分两个阶段进行，前发酵，又称一次发酵或室外发酵;后发酵，或称第二次发酵，因其通常在室内进行，又称为室内发酵。
(1) 前发酵：采用粪草培养料的，前发酵时间较长，需15～20天;采用以稻草为主的合成培养料的，前发酵时间需10～15天：以麦秆为主的发酵时间较长。麦草吸水力差，应浸泡2～3天，稻草吸水快，只浸泡l天即可。干粪在堆制时用水调湿润。使用的粪和草均需先预湿。
(2)后发酵：后发酵方法有两种，即固定床架式后发酵和就地式后发酵，后者就是将前发酵的料就地建堆后发酵，但以前者为主，将培养料移人菇房后再一次发酵。通常前发酵以化学反应为主，要求高温快速;后发酵则是生物活动过程占优势，要求控温、控湿、通气。
