组织分离是采菇体的部分组织进行繁殖母种的方法。尽管平菇的任何部分都能分离培养出母种，但是多年的实践经验表明，选用菌柄和菌褶交接处的菌肉最好。平菇组织分离的方法和步骤如下：
一、种菇选择
一般选择在适宜出菇期出菇早、出菇整齐、特征典型、无病虫害、产量高的栽培袋，从中选择菌肉肥厚、大小适中、颜色正常、尚未散孢、长至七八分成熟的优质菇作种菇。
二、种菇消毒
用0.1%升汞溶液或75%酒精浸泡或擦拭，无菌水冲洗，吸干表面的水分。
三、切块接种
将分离种菇沿菌柄中心纵向掰成两半，用解剖刀在菌盖和菌柄交界处划成田字形，取黄豆粒大一小块菌肉组织，接在PDA培养基上。
四、培养纯化
温度控制在22℃－25℃之间，培养1－2天，长出白色绒毛状菌丝体，4－5天通过筛选，挑出菌丝洁白、清晰、生长整齐、健壮的试管母种继续培养，将有杂菌、长势纤弱的淘汰。7－10天菌丝长满斜面。
