一、母种的制作
1、培养基配方
黄豆芽500克(煮汁)，白糖20克，琼脂20克，羊肚菌基脚～50克，水1升。
黄豆芽500克(煮汁)，白糖20克，琼脂20克，水1升。
栎木屑500克(煮汁)，白糖20克，琼脂20克，水1升。
马铃薯200克(煮汁)，白糖20克，琼脂20克，蛋白胨0.5克，牛肉膏0.5克，水1升。
蛋白胨1克，葡萄糖20克，琼脂20克，酵母膏1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁1克，维生素B1，1克，水1升。pH值自然。
上述配方任选一组。将木屑或豆芽加水1升煮30分钟，过滤取汁，并将余下的水补足1升，加入其它原料，煮至溶化后，按母种制作常规方法，分装于18毫米×180毫米或20毫米×200毫米试管的1/5，塞上棉塞，使用高压灭菌锅彻底灭菌;在0.68千克压力下维持60分钟，自然冷却至指针回到原位才可打开，放成斜面备用。
2、菌种分离
(1)分离方法
羊肚菌分离需要一种助生菌与羊肚菌菌丝共生时才能出菇，这种助生菌长期活动在土壤中，有时以芽孢菌形式出现，它为羊肚菌的原基形成和子实体生长发育起着至关重要的作用。因此从土壤中分离该菌比其它任何方式分离要好些，初学者可在四川绵阳市食用菌研究所购买培养好的羊肚菌优良母种，并参加现场培训。
(2)操作过程
在羊肚菌生长的周围，可见白色菌丝充满土壤。从土壤中挑选这种菌丝容易成功。
浸提分离法：将基脚土用无菌水稀释，澄清后用接种针蘸取少量溶液，滴到试管内的空白培养基上，塞上棉塞后取出培养。分离后，放在12～18℃温度下培养观察。一旦菌种分离成功，在以后的转接过程中要小心，不能再让杂菌感染，必须把好高温灭菌关和接种消毒关，才能保证菌种质量和成活率。
3、转接提纯
待培养基表面余水干后才能使用，否则会被细菌感染。接种要求在接种箱内通过药物灭菌进行，将第一代纯母种挑取黄豆大一块带菌丝的培养基，放入空白培养基上，每支母种可接10～15支，母种只能扩种一次，不能多接或多扩，否则会影响子实体生长。
4、培养
接种后放在18～22℃温度下避光培养，2～3天菌丝萌发，7天可长满斜面培养基。
二、原种制作
1、培养基配方
栎木屑50%，棉籽壳30%，麦麸 15%，白糖1%，石膏1%，过磷酸钙1%，土2%，pH值自然。
栎木屑75%，米糠或麦麸20%，白糖1%，石膏1%，过磷酸钙1%，土2%，pH值自然。
稻草粉70%，麦麸25%，石膏1.5%，过磷酸钙1.5%，土2%，pH值自然。
棉籽壳90%，木屑8%，土2%，pH值自然。
玉米芯50%，木屑30%，米糠15%，石膏1%，过磷酸钙1%，土3%，pH值自然。
2、操作过程
按配方将原料混合均匀，加入清水，使含水量达65%时装瓶。装瓶要求松紧一致，装瓶后塞上棉塞封口。
3、灭菌
高压灭菌在0.68千克压力下维持1小时，常压灭菌在100℃温度下保持6～8小时。
4、接种与培养
接种在接种箱内经消毒后，每支母种可接种原种5～10瓶。接种后放在18～22℃温度下避光培养，培养期间尽量避免强光刺激，菌龄以不超过50天为好。
三、栽培种制作
1、培养基配方
栎木屑75%，米糠或麦麸20%，白糖1%，石膏1%，过磷酸钙1%，土2%，pH值自然。
棉籽壳75%，麦麸20%，石膏1%，过磷酸钙1%，土3%，pH值自然。
稻草粉75%，麦麸15%，过磷酸钙2%，土3%，pH值自然。
玉米芯80%，米糠15%，石膏2%，过磷酸钙1%，土2%，pH值自然。
农作物藤秆粉75%，米糠10%，麦麸10%，白糖1%，石膏1%，过磷酸钙1%，土2%，pH值自然。
2、操作过程
按配方将原料混匀后，加水调至含水量为65%，装瓶，灭菌接种，培养，操作方法同上述原种。经1个月菌丝长满瓶后就可用于生产栽培。
