什么是孢子分离法？ 孢子分离法是利用食用菌成熟的有性孢子即担孢子、子囊孢子，无性孢子即厚垣孢子、节孢子、粉孢子等萌发成菌丝，来获得纯菌种的一种方法。食用菌栽培，菇农最为关切的问题是菇的产量、质量(韧性)、抗病性和商品外观。一个优良菌株的产生，主要来自于野生菌株的采集和驯化，而采用孢子分离法来取得菌种是行业中普遍采用的方法。由于孢子的数量大，变异的机会多，因此采用孢子分离法，可以有更多选择优良菌株的机会，而且孢子的生活力强，所得菌种菌龄小，生活力旺盛。但是有些食用菌的担孢子不易萌发成菌丝，还有些食用菌的孢子有两种或四种极性，单孢分离的菌株有时不产生子实体，必须经过交配，得到结实性的双核菌丝，才能用于产生。故孢子分离法又有单孢分离法和多孢分离法两种。
单孢分离法是指每次只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的一种方法。 蘑菇用单孢分离法得到的菌丝，有结实能力，因此可以采用单孢分离法生产纯菌种。其他食用菌如香菇、平菇、金针菇、凤尾菇、毛木耳等，只有育种时，才用单孢分离法。单孢子分离用多孢子作材料，自由交配育出的菌种，有很多不可知因素，为了科学地利用孢子，进行单孢子杂交，必须得到单孢子分离物。单孢子分离比多孢子分离麻烦得多。为了使食用菌的孢子彼此分开，最可靠的方法是在显微镜下，用显微镜操作器挑取一个个已萌发的孢子单孢进行培养，这种方法要有一定的设备，只有专门的育种单位才选用这种方法。目前最简单的方法是采用连续稀释法。用无菌水把孢子冲散，降低一定体积中孢子的密度，使最后一滴水中含有1-2个孢子，然后把含1-2个孢子的水滴滴在或涂在琼脂平板上，培养后，再挑取单个菌落中的菌丝进行培养。经镜检确认是单孢子的分离物时才保留下来，这样就可以得到单孢子分离的菌株了。单孢子分离用于异宗结合菌类的杂交育种和同宗结合的单孢育种。属异宗结合的菌类，单孢子分离可以用来作杂交育种。
多孢分离法就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发，自由交配来获得食用菌纯菌种一种方法。此法简单易学，在生产上经常采用。具体操作方法，有以下几种：
①种菇孢子弹射法：选择种菇，切去大部分，种菇必须经过消毒，以清除沾染在它表面的杂菌孢子。对于子实层已外露的种菇只能用75%酒精在菌盖表面及菌柄部分进行揩擦消毒。用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇 为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。
还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入 20℃左右恒温箱培养。
②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。
③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。
④贴附法：按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块， 用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6～12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。
不管单孢分离还是多孢分离。想获得优良的母种一定要来自优良的种菇。收集孢子用的种菇必须发育纯正、健壮而无病虫害。种菇的成熟度也要适当，对于双孢蘑菇和草菇那样有菌膜的食用菌，最好选用菌膜将破而未破的，因为这样的种菇发育已成熟，而子实层又未污染，因此能很快散发出大量的无菌孢子。但是对香菇、侧耳那样没有菌膜或菌膜自幼已破的食用菌，可以选取八成熟的、正在释放孢子的个体，因为刚从担子上弹射出来的孢子基本上也是无菌的。以白灵菇为例，种菇的选择应从菌丝生长健壮有力、子实体生长旺盛、出菇均匀的菇房中，挑选菇盖圆整、呈扇形、色白的单生菇，成熟度要求七八分熟、无病虫的子实体。种菇采收后处理待用。